2023 Fiscal Year Annual Research Report
小胞体グルコース転移酵素が有するシャペロン機能の解析
| Project/Area Number |
21K05282
|
|---|
| Research Institution | Ritsumeikan University |
|---|
Principal Investigator |
武田 陽一 立命館大学, 生命科学部, 教授 (20423973)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | UGGT1 / SelenoF / 糖タンパク質品質管理 / オリゴマンノース型糖鎖 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
UGGT1はセレノプロテインF（SelenoF）とヘテロ二量体を形成することが知られているが、その複合体形成の詳細は不明であった。これまでの研究で、プルダウンアッセイによりSelenoFがUGGT1のTRXL2ドメインに結合することを明らかにした。さらに新たに開発した光親和性架橋剤をSelenoFのシステイン残基に選択的に導入し、UGGT1に対するSelenoFの空間的配向の決定を試み、SelenoFがUGGT1のTRXL3領域およびβS2とGT24の間のドメインにあるアミノ酸と共有結合を形成していることを明らかにした。これによって、UGGT1が認識するさまざまなサイズのミスフォールドタンパク質に対しSelenoFがアクセス可能であることを示し、糖タンパク質の品質管理に重要な役割を果たしていることを示唆する結果を得た。しかしながら、これをin vitroにおいて、生化学的に明らかにするためには、相当量のUGGT1とSelenoFが必要であるため、今年度は昆虫細胞を用いたUGGT1とSelenoF複合体の調製を行った。UGGT1は昆虫細胞を用いた発現系で培養液1Lあたり200 μg程度得ることができた。このUGGT1に対してすでに調製法を確立していた大腸菌発現系で得たヒトSelenoFとの複合化を試みたが、両者の複合体を得ることができなかった。そこで、SelenoFにおいても昆虫細胞発現系を構築した。得られた両タンパク質の複合化をプルダウンアッセイによって確認した。また、UGGT1とSelenoFのbacmidを同時に感染させた場合にもUGGT1-SelenoF複合体を得ることできた。これによってin vitro実験に供することが可能な量で、高純度のUGGT1-SelenoF複合体の調製法を確立した。しかしながらミスフォールド糖タンパク質のリフォールディング実験には至らなかったことから、さらなる研究が必要である。
|
