2021 Fiscal Year Research-status Report
抗菌L-アミノ酸オキシダーゼの金属による複合体形成と活性調節機序の解明
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21K05285
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
葛西 宏介 弘前大学, 保健学研究科, 准教授 (50400148)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 抗菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① LAAOに金属が配位するアミノ酸部位（348番目のヒスチジン、241番目のスレオニン、406番のアスパラギン酸）をアラニンに置換した変異型psLAAOを合成している。分泌シグナル付加、コドンを発現宿主に適した配列へ改変した人工遺伝子の作製、低温誘導、低濃度メタノールを添加することで分泌型（可溶化）・活性型・高純度タンパク質を常時安定して供することが可能である。348番目のヒスチジンをアラニンに変異させた変異型LAAOは作製済。241番目のスレオニンおよび406番目のアスパラギン酸をアラニンに変えた変異に着手している。
② 異なるタグ配列（FLAG・His）を付加させた2種のpsLAAOを用いて、一方（FLAG）をFLAG特異的結合カラムに結合させ、もう一方(His)とキレート剤（EDTA）または異なる濃度の金属（亜鉛・マグネシウム）溶液を共に流入させたときの結合性をプルダウンアッセイにて評価する。カラムからの溶出はFLAGペプチドを、検出は抗His抗体を用いる。FLAGタンパク質のカラム結合性と抗His抗体での検出を評価した。
③ psLAAOをタンパク質架橋剤（BS3、DTSSP：側鎖にアミノ基をもつリシン同士を架橋）で処理することで複合体を検出することが可能であることから、上記変異型psLAAOと架橋剤を反応させたときの複合体形成をゲルろ過クロマトグラフィーならびに抗LAAO抗体（作成済み）を用いて検出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遺伝子を宿主に導入するためのベクター（サーモサイエンティフィック社）が突然販売停止となったことに伴い、ベクターを自作している。そのため進捗に遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
複合体形成に関する組換えタンパク質合成のためのベクターを作製している。進捗の遅れを取り戻すべく作業を進めている。
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