2022 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of method for detecting viral protease activity using affinity competition
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21K05301
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
日高 興士 神戸大学, 研究基盤センター, 特命技術員 (30445960)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 上席研究員 (60293958)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 酵素活性 / 阻害剤 / ストレプトアビジン / ビオチン / プロテアーゼ / SARS-CoV / Mpro / PLpro |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、感染細胞に由来する新型コロナウイルスの2種のプロテアーゼを標的にリムーバブル阻害剤を各種合成し、モデル検体から親和性競合による酵素活性の検出を行い、感染細胞の有無の判定につながる画期的な検査薬の開発に向けて新型コロナウイルスの正確で簡便な新規検出法の確立をめざす。
R3年度にMproおよびPLproに関して大腸菌での発現を試みた結果、SDS-PAGE分析により、ともに大腸菌抽出液の可溶性画分に発現タンパク質と思われるバンドが検出された。特に、PLproに関しては最も主要なバンドとして検出され、大量発現に成功したことが示された。そこで、R4年度の取り組みにおいては、Mproの可溶性画分での発現量の増大を目的とした。分子設計に関しては、すでに報告されているMproの立体構造を参考にして、分子表面の一部のアミノ酸を改変することとした。今回は、アミノ酸側鎖が分子表面に存在する疎水性アミノ酸のうちから、比較的溶媒への露出が高く、酵素の触媒部位に影響を与えないと考えられる部位を選択した。変異体としては、I59R、F223E、F223E/L232Rの3種を作製することとし、変異体の発現プラスミドを作製したのちに、大腸菌発現を試みた。しかしながら、SDS-PAGEにて分析したところ、発現量の顕著な増大は認められなかった。
今後は、Mproに関しては収量が少ないことが見込まれるが継続して野生型を用いることとする。そして、既存のMproおよびPLpro阻害剤のビオチン化合成を再検討し、本リコンビナントMproやPLproを用いて共結晶構造の解析や生体資料からの酵素活性の検出を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
R3年度の取り組みにおいて、MproおよびPLproに関して大腸菌での発現を試み、SDS-PAGEにて分析した結果、ともに大腸菌抽出液の可溶性画分に発現タンパク質と思われるバンドが検出されている。とくに、PLproに関しては、もっとも主要なバンドとして検出されたことから、大量発現に成功していることが示されている。そこで、R4年度の取り組みにおいては、Mproの可溶性画分での発現量の増大を目的とした。分子設計に関しては、すでに報告されているMproの立体構造を参考にして、分子表面の一部のアミノ酸を改変することとした。今回は、アミノ酸側鎖が分子表面に存在する疎水性アミノ酸のうちから、比較的溶媒への露出が高く、酵素の触媒部位に影響を与えないと考えられる部位を選択した。変異体としては、I59R、F223E、F223E/L232Rの3種を作製することとし、変異体の発現プラスミドを作製したのちに、大腸菌発現を試みた。しかしながら、SDS-PAGEにて分析したところ、発現量の顕著な増大は認められなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
Mproに関しては、収量が少ないことが見込まれるが、継続して野生型を用いることとする。
ビオチン化Mpro阻害剤については、公開済みのPF-07321332の合成経路を参考に経路を修正し、リムーバブル阻害剤を獲得する。PLproについては既知の可逆的阻害剤から結合を妨げない部位にビオチンを繋いだ誘導体を獲得する。
精製したMproおよびPLproのリコンビナント体とビオチン化阻害剤との共結晶構造を解析してビオチン化部位の最適化を図る。生体資料にMproおよびPLproを混入し、磁気ビーズによるアフィニティー精製と親和性競合を組み合わせた手法により各酵素活性を検出する。
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| Causes of Carryover |
当初を予定より学会出張が減少したために次年度使用額が生じた。本使用額は研究資材移設のために必要な経費や機器リース料、および消耗品の購入に使用する。
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