2023 Fiscal Year Annual Research Report

Establishment of method for detecting viral protease activity using affinity competition

Research Project

Project/Area Number	21K05301
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	日高興士神戸大学, 研究基盤センター, 特命技術員 (30445960)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	安達基泰国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 上席研究員 (60293958)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	酵素活性 / 阻害剤 / ストレプトアビジン / ビオチン / プロテアーゼ / SARS-CoV / Mpro / PLpro
Outline of Annual Research Achievements	本研究課題では、感染細胞に由来する新型コロナウイルスの2種のプロテアーゼを標的にリムーバブル阻害剤を各種合成し、モデル検体から親和性競合による酵素活性の検出を行い、感染細胞の有無の判定につながる画期的な検査薬の開発に向けて新型コロナウイルスの正確で簡便な新規検出法の確立をめざす。 R3年度にMproおよびPLproに関して大腸菌での発現を試みた結果、SDS-PAGE分析により、ともに大腸菌抽出液の可溶性画分に発現タンパク質と思われるバンドが検出された。特に、PLproに関しては最も主要なバンドとして検出され大量発現に成功した。 R4年度の取り組みにおいては、Mproの可溶性画分での発現量の増大を目的とし、すでに報告されているMproの立体構造を参考にアミノ酸側鎖が分子表面に存在する疎水性アミノ酸のうちから、比較的溶媒への露出が高く酵素の触媒部位に影響を与えないと考えられる部位を選択した。3種の変異体I59R、F223E、F223E/L232Rの発現プラスミドを作製したのちに大腸菌発現を試みたところ、SDS-PAGEでは発現量の顕著な増大は認められなかった。 R5年度はビオチン化Mpro阻害剤について、公開されたPF-07321332の合成経路を基にニルマトレルビルおよびリムーバブル阻害剤の合成を実施した。PLproについては既知の可逆的阻害剤から結合を妨げない部位にビオチンを繋いだ誘導体を設計した。精製した野生型Mproについてニルマトレルビルとの共結晶構造解析を試みた。しかし、R4年度末の職場火災の影響により研究環境が復旧するまでに想定外の時間がかかったため、実施計画どおりには研究は進まなかった。