2021 Fiscal Year Research-status Report
スフィンゴ脂質病の新規治療法を指向した光キャプチャーによるSMS2阻害様式の解明
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21K05303
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
村井 勇太 北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (20707038)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | スフィンゴミエリン合成酵素 / 光アフィニティーラベル / ノシル / スフィンゴ脂質 / ジアジリン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は独自のスフィンゴミエリン合成酵素2 (SMS2)選択的な阻害剤を搭載したノシルジアジリン型光アフィニティーラベル (NsPAL)プローブの作成を行なった。当初の計画通り、阻害剤のスフィンゴシン尾部末端にNsジアジリンを導入したものを構築し、NsPALプローブの阻害活性を確認したところ、SMS2選択性およびIC50値0.2uMを保持していることが確認できた。続いてこのNsPALプローブの光ラベル効率を検討するため、光照射によるジアジリン基の光分解を検討した。ジアジリン基の一般的な光分解波長は365nmであるが、本プローブでは分解効率が悪かった。そこで光波長を325-385nmのレンジで照射したところ、0℃、10分で完全に光分解を達成することに成功した。さらにNsPALプローブによる標的分子の光ラベル後は、Ns基特有の芳香族求核置換反応 (SNAr)を利用し、標的分子に検出タグ導入を考えていることから、SNAr条件についても検討を行なった。初め、検出タグとしてBodipy-SHを構築したが、脂溶性が高く生体分子への非特異的吸着が見られた。そこで親水性のPEG鎖をBodipyとチオール基の間に挿入することで、非特異的吸着を可能な限り抑制し、水溶性を保持したBodipy-PEG-SHを作成した。またSNAr反応は通常、有機溶媒中、加熱、塩基条件が必要とされるが、PAL法は水中で実施されるためSNArの効率的な条件を検討する必要があった。これまでの種々条件検討の結果、pH 9.0、 炭酸緩衝液中、70℃で反応が進む知見を得ていたが、副生成物による低収率がボトルネックであった。今回はさらに条件検討を行い、室温、超音波中で実施したところ効率良くSNArが進行することを見出すことにも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的であったSMS2選択的な阻害剤を搭載したNsPALプローブの作成にとどまらず、次年度前半に実施する予定であった、PALプローブとしての有用性の確認、SNAr条件の最適化まで達成することができた。既に、PAL実験で使用するSMS2はFLAGタグやHisタグを導入したもので過剰発現を行い、PAL法に十分なタンパク量確保にも成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はNsPALプローブとSMS2を相互作用させ、１）光ラベル、２）SNAr、３）釣り上げタンパクの確認、解析を実施する。1)、2)の各ステップは本年度で確立した条件を用いて実施する。3)釣り上げタンパクのSDS-PAGE後、Bodipyのin gel蛍光によってSMS2釣り上げ有無の検証を行う。さらに蛍光標識されたバンドがSMS2であることを確証するため、FLAGやHisタグ検出抗体を用いて、蛍光バンドと重なっていることを確認する。
in gel蛍光でバンドが確認できない場合は、１）あるいは２）のステップがうまくいっていない可能性が示唆されるため、NsPALプローブやBodipy-PEG-SHの濃度を調節し、３）の検出が成功するよう条件検討を行い対処する予定である。BodipyによるSMS2の蛍光標識がうまくいった場合は、他の検出タグ（イオン増感剤など）に変更し、マルチなタグが導入可能かどうかについても検証を行い、本NsPALプローブの汎用性を高めたいと期待している。
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| Causes of Carryover |
未使用額が生じたのは今年度の研究計画が予定通り遂行でき、無用な執行は行わず、次年度の研究に役立てようと考えたためであり、次年度の試薬代等に使用する予定である。
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Research Products
(11 results)
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[Presentation] Malabaricone C as a novel SARS-CoV-2 inhibitor from spices2022
Author(s)
Mutmainah, Yuta Murai, Sajeer Koolath, Seigo Usuki, Kohei Yuyama, Shinji Nakaoka, Michihito Sasaki, Yasuko Orba, Akihiko Sato, Yasuyuki Igarashi, Hirofumi Sawa, Kenji Monde
Organizer
日本化学会 第102春季年会
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[Presentation] A novel SARS-CoV-2 inhibitor found in the spice of Myristica fragrans2021
Author(s)
Mutmainah, Yuta Murai, Sajeer Koolath, Seigo Usuki, Kohei Yuyama, Shinji Nakaoka, Michihito Sasaki, Yasuko Orba, Akihiko Sato, Yasuyuki Igarashi, Hirofumi Sawa, Kenji Monde
Organizer
第15回スフィンゴテラピー研究会
