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2022 Fiscal Year Research-status Report

スフィンゴ脂質病の新規治療法を指向した光キャプチャーによるSMS2阻害様式の解明

Research Project

Project/Area Number 21K05303
Research InstitutionHokkaido University

Principal Investigator

村井 勇太  北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (20707038)

Project Period (FY) 2021-04-01 – 2024-03-31
Keywordsスフィンゴミエリン合成酵素2 / 光アフィニティーラベル / クリックケミストリー / スフィンゴ脂質 / 化学プローブ
Outline of Annual Research Achievements

本年度は、昨年度作成に成功したスフィンゴミエリン合成酵素2(SMS2)選択的な阻害剤を搭載したノシルジアジリン型光アフィニティーラベル (NsPAL)プローブを用いてSMS2釣り上げ実験を実施した。NsPALプローブならびに検出タグ、光ラベル架橋時間の条件検討を幾度と行ったが、残念ながら目的であるSMS2(分子量43kDa)のバンドを検出するに至らなかった。そこで、代替案として準備していたSMS2阻害剤に直接ジアジリン基およびアルキンタグを導入した第二のアルキン型PALプローブの作成を行なった。12ステップで目的のアルキン型PALプローブの作成に成功し、またSMS2阻害活性を評価したところSMS2選択性およびIC50値:40 nM(オリジナル20 nM)を維持していることを確認した。続いて、新たに作成したPALプローブを用いて、SMS2釣り上げ実験を実施した。今回、光ラベル後の検出基導入についてはPALプローブ中のアルキンを利用したクリックケミストリーによってビオチン導入を実施した。ビオチン導入後はアビジン精製、SDS-PAGEを行い、最後にSMS2に導入してあるFLAGタグの抗体検出によって釣り上げの評価を行なった。また比較実験として、1)PALプローブのみを用いたケース、2)PALプローブと競合剤を用いたケース、3)PALプローブを用いないケースをSMS2過剰発現させたHEK293ライセートと過剰発現させていないHEK293ライセート(ネガティブコントロール)で実施した。その結果、通常のHEK293ライセートでは43kDa付近のバンドは一切確認されなかった。いっぽう過剰発現細胞ではPALプローブの有無でバンドの濃さに大きな差があり、また競合剤をいれたものは若干バンドが薄いことも確認できた。現在は、このバンドをゲル内消化し、MS/MS測定に移行している。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

最初に予定していたNsPALプローブでは、SMS2の釣り上げに至らなかったものの、代替のアルキン型PALプローブの合成およびPAL実験の移行まで進捗した。さらにSMS2釣り上げ実験では、ネガティブコントロールならびにPALプローブの有無によって目的のSMS2バンドの検出に明瞭な差がでており、SMS2の釣り上げ成功が期待できるレベルまで到達できた。現在、MS/MS解析まで移行しており、残りの一年で結合部位解明の期待がより一層高まったと言える。

Strategy for Future Research Activity

今後は、MS/MS解析による解析結果によって成功した場合は、現在共同研究を実施している理研の本間博士と計算科学を用いた阻害剤とタンパクのドッキングシュミレーションを予想する。さらに、よりSMS2の活性ポケットにフィットする低分子化合物の立案を行う。まだ釣り上げがうまくいっていない場合は、SMS2量をより多く確保し、再度釣り上げ実験に挑戦する予定である。

Causes of Carryover

未使用額が生じたのは今年度の研究計画が予定通り遂行でき、無用な執行は行わず、次年度の研究に役立てようと考えたためであり、次年度の試薬代等に使用す
る予定である。

  • Research Products

    (9 results)

All 2023 2022

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results,  Open Access: 2 results) Presentation (5 results)

  • [Journal Article] Heteroaromatic Diazirines Are Essential Building Blocks for Material and Medicinal Chemistry2023

    • Author(s)
      Murai Yuta、Hashimoto Makoto
    • Journal Title

      Molecules

      Volume: 28 Pages: 1408~1408

    • DOI

      10.3390/molecules28031408

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Evaluation of Plant Ceramide Species-Induced Exosome Release from Neuronal Cells and Exosome Loading Using Deuterium Chemistry2022

    • Author(s)
      Murai Yuta、Honda Takumi、Yuyama Kohei、Mikami Daisuke、Eguchi Koichi、Ukawa Yuichi、Usuki Seigo、Igarashi Yasuyuki、Monde Kenji
    • Journal Title

      International Journal of Molecular Sciences

      Volume: 23 Pages: 10751~10751

    • DOI

      10.3390/ijms231810751

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] A near-infrared fluorescent long-chain fatty acid toward optical imaging of cardiac metabolism in living mice2022

    • Author(s)
      Swamy Mahadeva M. M.、Zubir Mohamad Zarif Mohd、Mutmainah、Tsuboi Setsuko、Murai Yuta、Monde Kenji、Hirano Ken-ichi、Jin Takashi
    • Journal Title

      The Analyst

      Volume: 147 Pages: 4206~4212

    • DOI

      10.1039/D2AN00999D

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Shortwave-infrared (SWIR) emitting annexin V for high-contrast fluorescence molecular imaging of tumor apoptosis in living mice2022

    • Author(s)
      Swamy Mahadeva M. M.、Tsuboi Setsuko、Murai Yuta、Monde Kenji、Jin Takashi
    • Journal Title

      RSC Advances

      Volume: 12 Pages: 19632~19639

    • DOI

      10.1039/d2ra03315a

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 光アフィニティーラベル用スフィンゴミエリン合成酵素2選択的阻害剤の創製と結合ドメイン解析の評価2023

    • Author(s)
      阿部 美良乃、村井 勇太、佐藤 長緒、眞木 美帆、光武 進、谷口 真、門出 健次
    • Organizer
      日本化学会 第103春季年会
  • [Presentation] 細菌由来セリンパルミトイル転移酵素の基質認識に関する構造学的考察2022

    • Author(s)
      生城浩子、村上大毅、高橋亜弥、竪山あすか、澤井大樹、後藤春菜、サジール クーラス、本田拓巳、村井勇太、門出健次、宮原郁子、神谷信夫、矢野貴人
    • Organizer
      日本生化学会
  • [Presentation] スフィンゴミエリン合成酵素2と阻害剤間の結合様式解明を指向した新規光キャプチャー創製の研究2022

    • Author(s)
      阿部 美良乃、村井 勇太、佐藤 長緒、眞木 美帆、門出 健次
    • Organizer
      第15回セラミド研究会
  • [Presentation] 植物型スフィンガジエニンによる皮膚バリア改善効果の機序解明研究2022

    • Author(s)
      奥川 真奈美、村井 勇太、湯山 耕平、門出 健次
    • Organizer
      第15回セラミド研究会
  • [Presentation] 精巣、精子活性に関わる多価不飽和極長鎖脂肪酸含有スフィンゴ脂質の合成2022

    • Author(s)
      大塚 汐里、村井 勇太、門出 健次
    • Organizer
      第15回セラミド研究会

URL: 

Published: 2023-12-25  

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