2022 Fiscal Year Research-status Report

Structural analysis of target proteins based on multifunctional photoaffinity labeling

Research Project

Project/Area Number	21K05304
Research Institution	University of Toyama
Principal Investigator	友廣岳則富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 教授 (70357581)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	photoaffinity labeling / diazirine / chemical probe
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、多機能を集積した独自の小型光反応基を改良し、生理活性リガンドのターゲットタンパク質同定効率を向上しつつ、従来法では困難であったリガンド結合ドメインにおける複数ラベル部位同定を達成する。それらラベルアミノ酸残基の位置情報にラベル量情報を加えることで、リガンド相互作用状態の微細な構造変化を追跡し評価し得る、新たな光アフィニティーラベル法（PAL）への展開を図る。初年度、o-ヒドロキシ桂皮酸を母核とし、ジアジリン基導入位置をベンゼン環からアルキル鎖にした新たな発蛍光性光クロスリンカーを開発した。このクロスリンカーを導入したリガンドプローブによるPALでは、従来型に比較してラベル収率が大幅に向上し、さらに酵素活性中心近傍をラベルすることが明らかとなり、ジアジリン基部分の大きさや柔軟性がタンパク質のリガンド相互作用部位ラベルにおいて重要な要因であることが示された。しかし、アルキルジアジリン由来の多様な副反応によりMS解析が極めて複雑化し、大部分のラベル部位が同定困難であった。それら副反応を抑えるため、２年目では新たにトリフルオロメチル置換型アルキルジアジリン誘導体開発に取り組んだ結果、複数の誘導体を合成することに成功した。一方、極微量ラベルタンパク質、および複数ラベル部位解析の効率化を目的とした銅触媒アジド－アルキン環化付加反応（CuAAC）の高速化法の開発では、まずアジド基導入ペプチド銅配位子を最適化した。別途、PALでアルキニル化したタンパク質を調整し、これを用いてCuAACを検討したところ、タンパク質の系においても汎用銅配位子TBTAに比べ、収率と反応速度の大幅な向上が確認できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 初年度、新たな発蛍光性光クロスリンカーを開発し、炭酸脱水酵素（CA）の競合阻害剤であるベンゼンスルホンアミドに導入して光プローブを作製した。このプローブによるPALでは、従来のフェニルジアジリン型に比較してラベル収率は10倍以上向上し、さらにCA酵素活性中心近傍アミノ酸残基をラベルすることが明らかとなった。これによりジアジリン基部分の大きさや柔軟性がタンパク質のリガンド相互作用部位ラベルにおける重要な要因であることがわかった。しかし、ラベル部位の同定では、カルベン中間体から派生する多様な副反応によってMSによるラベル解析が極めて複雑化し、大部分のラベル部位が同定困難であることが判明した。そこで主要な副反応を抑えるべく、新たなアルキルジアジリン誘導体の開発に取り組んだ。これにより予定に遅れを生じたが、種々検討した結果、ケトンメタセシスを利用した合成経路が合成ステップ数や収率、汎用性の面で有用であり、最終的に目的のトリフルオロメチル置換型アルキルジアジリン誘導体の合成を達成した。一方、銅触媒アジド－アルキン環化付加反応（CuAAC）では、収率や反応速度の大幅な向上を達成した、アジド基を導入した特定ペプチドを銅配位子の最適化を検討した。別途、アルキニル基を有するジアジリン光クロスリンカーをATPγ位リン酸基に導入した光反応性ATPプローブを作製した。これを用いたPALでグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（GDH）にまずアルキンを標識し、続いてCuAACによるアルキニル基へのポストビオチン化を検討した。タンパク質の系でも、TBTAに比べて収率と反応速度の大幅な向上が確認でき、これにより極微量ラベルタンパク質、および複数ラベル部位解析の効率化のための基盤技術となりうることが示された。
Strategy for Future Research Activity	ジアジリン光分解生成物であるカルベン中間体の転移反応や、ジアゾニウム中間体の酸性アミノ酸との反応を抑えるため、２年目には新たなトリフルオロメチル置換型アルキルジアジリン誘導体を開発した。最終年度では、この光反応特性を確認したのち、桂皮酸型発蛍光性光クロスリンカーユニットに誘導し、さらに光反応性リガンドプローブを調整する。CAあるいはGDHのPAL解析では、LC-MS/MSによるラベルアミノ酸残基同定、および蛍光LCによる各ラベル量の評価を行い、リガンド相互作用状態の微細な構造変化を追跡しうる新たな解析法に向けた基礎知見を得る。一方、極微量ラベルタンパク質、および複数ラベル部位解析の効率化を目的としたCuAACの高速化では、切断基導入による煩雑な濃縮・精製操作の簡便化を推進しながら、微量光ラベル解析の効率化を図る。
Causes of Carryover	現地開催を予定していた参加学会がオンライン開催となり、また光照射装置光源の交換の必要がなかったことなどによる。光照射装置光源の交換、分離分析用消耗品、生化学系試薬などの購入に使用する。