2022 Fiscal Year Research-status Report
様々な代謝経路活性の一細胞検出を可能とする新規蛍光イメージング戦略の開発
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21K05312
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
内之宮 祥平 九州大学, 薬学研究院, 助教 (10770498)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | β酸化 / フッ化物イオン / シリルエーテル保護基 / 夾雑系での蛍光検出 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度ではシリルエーテル保護基にアルコキシ基を導入することで、従来のフッ化物イオンを検出する蛍光プローブで用いられているシリル保護基（TBS, TBDPSなど）と比較して、フッ化物イオン応答性を500倍以上向上させることに成功した。本年度は論文化に向けて、反応速度論解析やpH応答性、様々なアニオン種との選択性の比較などのデータを得るとともに、アプリケーションとして生体夾雑系において酵素反応に伴い放出されるフッ化物イオンの検出を行った。まずエステラーゼと反応後にフッ化物イオンを放出する基質を用いて、細胞ライセート内でのエステラーゼ活性の蛍光検出に成功した。さらに、脂肪酸を分解する代謝経路であるβ酸化の蛍光検出に取り組んだ。β酸化によって代謝されることでフッ化物イオンを放出する基質を細胞に添加し、細胞を破砕後のライセートにクマリンを有する蛍光プローブを加えたところ、蛍光強度の上昇を確認した。この蛍光上昇はβ酸化の阻害剤を添加した際は検出されなかったことから、本システムを用いてβ酸化活性を検出可能であることが分かった。さらに、クマリン以外の蛍光色素としてナフタルイミドを有するプローブでも蛍光検出が可能であり、様々な蛍光色素でβ酸化を検出可能であることが分かった。現在は本システムを用いた生細胞イメージングを検討中である。生細胞にクマリンを有する蛍光プローブを添加し、続いてフッ化物イオンを添加したところ、細胞内での蛍光上昇を確認した。この蛍光上昇はフッ化物イオンを添加しなかった場合は確認されなかったことから、本システムを用いて生細胞内でもフッ化物イオンをイメージングできることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在論文化に向けたデータを取得しており、反応速度論解析やアニオン種との選択性の比較に加え、細胞ライセートでの酵素反応の蛍光検出も達成した。さらに、生細胞でのβ酸化活性の検出にも成功している。今後は生細胞イメージングに向けた検討を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在は生細胞イメージングに向けた検討を行っており、細胞内での蛍光プローブの局在の制御などを行っている。まず生細胞にクマリンを有する蛍光プローブを添加し、続いてフッ化物イオンを添加したところ、細胞内での蛍光上昇を確認した。一方、細胞内の特定の部位に集積していることや、フッ化物イオンへの応答速度がin vitroよりも遅いことが分かった。これはクマリンを有する蛍光プローブの疎水性が高いため、凝集していることが原因として考えられる。そこで今後の研究方針としては、生細胞内の酵素反応イメージングに向けて、プローブ局在や物性の制御を行う。さらに、クマリン以外の長波長蛍光色素を用いたプローブ開発を行い、様々な酵素反応や細胞刺激時の酵素活性変化の蛍光イメージングを目指す
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| Causes of Carryover |
本年度はin vitroや細胞ライセートでの検討が主であったこと、所属研究室の物品を使用することが可能であったことが原因で、次年度使用額が生じた。一方、次年度では生細胞でのイメージングのための検討を行うことを計画しており、細胞刺激用の試薬を用いた細胞実験に加え、様々な蛍光色素を用いた合成実験を行う。これらの試薬は比較的高価であるため、次年度使用額を利用して購入する予定である。
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