2022 Fiscal Year Research-status Report

プロテオーム研究を新たな次元に導く革新的なMSサンプル調製方法の確立

Research Project

Project/Area Number	21K05322
Research Institution	防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群)
Principal Investigator	市村徹防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群), 応用科学群, 教授 (50213012)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	竹清貴浩防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群), 応用科学群, 准教授 (00545981) 田岡万悟東京都立大学, 理学研究科, 准教授 (60271160)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	プロテオミクス / LC-MS/MS / イオン液体 / pTRUST / iBOPs
Outline of Annual Research Achievements	プロテオーム研究を新たな次元に導くには、あらゆる試料の分析に共通に適用できる標準的なMSサンプル調製方法の確立が重要である。これまでの研究で我々はイオン液体‐アルカリ水溶液の混合溶媒（i-soln)と疎水性マイクロビーズ吸着体を利用する新しいMSサンプル調製法（iBOPs法）を開発した。また、iBOPs法をStageTip法と組み合わせたディスポーザブルな試料前処理方法（pTRUST法）を考案し、ヒト赤血球から調製した不溶性膜タンパク質画分を対象にその分析性能を評価した。本研究では、pTRUST法の各手順を評価・至適化するとともに、本法をヒト赤血球と3種類のヒト培養細胞に由来する膜サンプルの分析に実際に適用し、その有効性の確認を試みた。モデルタンパク質を用いた検討によって、pTRUST法はプロテオミクスの未経験者でも容易にプロテオーム解析を実施できることを確認した。またpTRUST法の操作プロトコルを創出した。次にヒト試料から調製した微少量の膜タンパク質をpTRUST法を用いて消化しLC-MS/MS分析したところ、多くの膜内在性タンパク質を含む膜タンパク質が再現的かつ定量的に同定できることが明らかとなった。またこの性能は、SDSを用いるFASP法やC12-Clを用いるi-FASP法をはるかに上回ることを確認した。以上の結果から、pTRUST法は、微量な膜タンパク質を含むヒト細胞タンパク質を簡便、かつ感度よく処理できる新しいプロテオミクスプラットフォームになると結論した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度の研究で、i-solnが赤血球膜に存在する膜内在性タンパク質をSDS等の界面活性剤と同等の効率で可溶化できることを確認した。一方今年度の研究で、i-solnが赤血球以外にもヒト培養細胞に由来するさまざまな膜内在性タンパク質の可溶化にも同様に適用できることを確認した。それゆえ、i-solnは多種多様な膜タンパク質の抽出に共通に適用できる可溶化溶媒であることが実証された。また、i-solnで可溶化した膜タンパク質を簡便にトリプシン消化できる方法として、pTRUST法並びにそのプロトコルを確立した。
Strategy for Future Research Activity	プロテオーム研究におけるi-soln及びpTRUST法の有用性をさらに評価するために、SDSを用いた従来法では抽出・可溶化が困難であった細菌芽胞のタンパク質分析に適用する。
Causes of Carryover	（理由）今年度の研究において、pTRUST法を開発でき様々な膜タンパク質の分析に適用することができた。これらの実験を実施するにあたり、問題はほとんど生じなかった。しかし、次年度に計画している細菌芽胞のプロテオーム研究の成否は、まったく未知数であったことからこれを行うための予算が残った。（使用計画）芽胞を形成する細菌としてまず枯草菌を取り上げ、それの芽胞をi-solnで可溶化し、pTRUST法で分析する。また、確立した手法を、他の芽胞細菌である納豆菌やセレウス菌なのにも適用し、その有用性を評価する。