2021 Fiscal Year Research-status Report
Search and functional analysis of maturation genes for syntrophic propionate oxidation using genomic information
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21K05343
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
高坂 智之 山口大学, 大学研究推進機構, 准教授 (70500453)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松谷 峰之介 東京農業大学, その他部局等, 研究員 (70380558)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 成熟化遺伝子 / プロピオン酸酸化細菌 / コハク酸脱水素酵素 / ヒドロゲナーゼ / 異種発現 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) ゲノム情報を基にした成熟化候補遺伝子の選抜
プロピオン酸酸化細菌のゲノム配列を活用して、コハク酸脱水素酵素(SDH)とヒドロゲナーゼ(HYD)を対象とした成熟化候補遺伝子の選抜を試みた。SDHのFAD結合に関与する可能性がある遺伝子の探索は、大腸菌のSDH成熟化に関わるSdhEを活用し実施した。解析の結果、SDHの成熟化に関与する遺伝子候補はSDHのサブユニット以外には明確には選抜されなかった。そこで選抜の方法や閾値を下げて候補遺伝子を求めたところCCB3 family遺伝子を見出したが、同時発現によるプロピオン酸酸化細菌のSDHのFAD結合は起こらず、同様の機能を有する遺伝子が存在する可能性が低いことが示唆された。一方HYDの成熟化候補遺伝子の探索をゲノム配列を活用して行なったところ、候補遺伝子群を選抜することができた。
(2) 成熟化候補遺伝子群の機能解析
HYDの成熟化に関わる遺伝子のうち、活性中心を有するサブユニットの成熟化に関わるエンドペプチダーゼを大腸菌で発現させた結果、大腸菌のヒドロゲナーゼ活性が低下した。このことは、異種菌株である大腸菌内でエンドペプチダーゼが機能する可能性を示唆した。
(3) 成熟化が必要な酵素の機能化解析について
解析対象としている酵素の異種微生物での成熟化について、SDH及びHYDで検討を行なった。いずれの酵素も活性を測定する系の構築は完了した。SDHは大腸菌、コリネ型細菌、枯草菌での発現を試み、異なる微生物間での交換が可能なSDHとそうでないSDHの存在が明らかとなりつつある。一方HYDは大腸菌での異種発現とその解析を試みているが、活性に対する結論はまだ出ていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
成熟化遺伝子の探索方法と解析用菌株の構築は概ね計画通りに進行している。また、異種タンパク質の発現解析に向けた蛍光タンパク質やタグの活用による分析系も構築は完了した。一方、成熟化候補遺伝子の機能解析はそれほど進んでいない。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) ゲノム情報を基にした成熟化候補遺伝子の選抜
SDHの成熟化遺伝子の探索は、HYDの成熟化候補遺伝子の探索手法の検討の結果を基に再度行う予定である。一方、HYDに関してはこれまでに見出された成熟化候補遺伝子の情報を基にして、さらに遺伝子を選抜するとともに、この手法を洗練することにより、ゲノム内の全遺伝子において成熟化に関わる遺伝子が存在するかしないかを分析していく。
(2) 成熟化候補遺伝子群の機能解析
HYDの成熟化候補遺伝子の機能解析を大腸菌の一遺伝子破壊株ライブラリーを活用して実施する予定である。この際に、一遺伝子破壊ではそれぞれの機能が補完されることでHYDへの影響が見られない場合は複数の遺伝子の破壊株を構築する。また、現状は同時発現として個別の遺伝子のみを実施しているが、複数の遺伝子の発現による酵素活性への影響を分析していく。
(3) 成熟化が必要な酵素の機能化解析について
大腸菌、コリネ型細菌、枯草菌を活用して異なる菌株間での各種酵素の発現と機能解析を実施し、属が異なる種での機能化の違いを明確にしていく。さらに、系統解析の結果から独立した分類群に属している遺伝子を選抜し、それらの遺伝子の機能化がどのような分類になるかを明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の状況にあり出張旅費ならびに消耗品費の支出が結果的に抑えられた。
2022年度は学会発表や論文投稿を積極的に実施する。
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