2022 Fiscal Year Research-status Report
S-スルフヒドリル化タンパク質の網羅的解析による含硫化合物生合成機構の解明
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21K05345
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
加藤 伸一郎 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 准教授 (60346707)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 硫黄代謝 / トレーサー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに大腸菌MC4100株の無細胞抽出液にL-[35Ｓ]システインをトレーサーとして添加し、タンパク質合成の阻害条件下にて、37℃で１時間インキュベートした後に試料をSDS-PAGEにより解析したところ、S-スルフヒドリル化されることにより硫黄の転移反応に関与すると考えられるタンパク質バンドがオートラジオグラフィーにより複数検出されている。オートラジオグラフィーの結果は培養条件により影響を受けており、S-スルフヒドリル化タンパク質の標識量が変動していた。これは特異的に発現誘導された結果と考えられた。分子質量16kDaのバンドが検出されていたが、これはIscUタンパク質であることが判明したため、当該遺伝子をPCRにより調製し大量発現系を構築した。この発現系より得られた組換えIscUタンパク質について、L-[35Ｓ]システインと大腸菌システインデスルフラーゼIscSを用いた硫黄転移系を用いてin vitroで硫黄受容能を解析した結果、35Ｓ放射標識量が経時的に増大していることが明らかになった。この結果から、IscUタンパク質は本菌株が生成する含硫化合物の合成初期段階において硫黄を供給する役割を担っていることが示唆された。他にもS-スルフヒドリル化タンパク質が検出されているが極微量であったため、プロテインシークエンサーを用いたエドマン分解では同定することが困難であった。その他の原因として、タンパク質のN末端がアセチル化やホルミル化によって修飾されている可能性も考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度の段階でS-スルフヒドリル化されるタンパク質の検出については、概ね予定通りに研究を進めることができた。発現量が微量で同定が困難であるため、実験をスケールアップするなどの対策により改善が見られつつある。なお今年度も、新型コロナウイルス感染症対策により研究活動に時間的な制限が生じたため、研究計画全般に若干の遅れが認められる。
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| Strategy for Future Research Activity |
検出されたS-スルフヒドリル化タンパク質は、プロテインシークエンサーおよび質量分析計を用いたペプチドマスフィンガープリンティングにより同定作業を進めていく。同定されたタンパク質はPCRにより遺伝子を調製して大腸菌を用いた発現系を構築していく。また、これらのタンパク質で検出されるS-スルフヒドリル化について、その機構の解明を目指し、L-[35Ｓ]システインおよびシステインデスルフラーゼを用いたin vitro解析系を利用し、反応条件の最適化および反応に必要な因子の探索・同定を行う。
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| Causes of Carryover |
計画的に使用していたものの、結果的に100円未満の次年度使用額が生じた。少額でもあり消耗品費の購入に充当したい。
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