パラベンを輸送するペプチドABCトランスポーターホモログの構造と機能柔軟性の解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05351
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 矢嶋 俊介 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (90301548)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: X線結晶構造解析 / 放線菌

Outline of Annual Research Achievements

非天然化合物であるhydrazide化合物を唯一の炭素源として資化できるMicrobacterium hydrocarbonoxydansから、その代謝を制御するオペロンを見出した。その特徴は、amidase superfamilyに属するhydrazidaseと、既知および新規構造の可能性をもつ２種のABCトランスポーターである。このオペロンは本菌のみならずActinobacteria門に見られること、またhydrazidaseホモログはbeta-proteobacteria綱にも見られることから、細菌の生理機能に重要な役割を担っていると考えられる。ゲノム配列のアノテーションではペプチド輸送が想定されたが、天然の輸送基質としてパラベンの可能性に至っている。現在までパラベントランスポーターは知られておらず、立体構造、機能解析を中心に、このオペロン構造の生理機能上の重要性解明、細菌のもつ生存戦略の分子メカニズム解明につなげることを目指している。
hydrazidaseはトランスポーターにより取り込まれた化合物を基質とすることから両者の基質は相関すると考え、基質としてのパラベンに普遍性が見られるかどうかを検討するため、ゲノム配列からホモログが存在するPseudnocardia acaciae由来のamidaseの組換え体蛋白質過剰発現と結晶化を検討した。His-tagを付加した組換体を大腸菌により発現をさせ精製を行ったところ、目的タンパク質以外にDnaK, GroELと思われるタンパク質が観察された。M. hydrocarbonoxydans由来のタンパク質では見られなかったことであるが、精製条件の精密化を進めつつ、結晶化スクリーニングを並行して行っているが、まだ結晶は得られていない。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

Microbacterium hydrocarbonoxydans由来のhydrazidaseとアミノ酸相同性が非常に高いにもかかわらず、予想外にP. nocardia由来hydrazidaseの組換え体蛋白質の挙動が異なるため、至適条件の決定に時間がかかっているため。

Strategy for Future Research Activity

トランスポーターの基質結合サブユニット(SBS)とhydrazidaseの基質が共通することをもとに輸送基質がパラベンであることを考えている。パラベンには誘導体があることから、それらが両タンパク質の基質となりうるのか、また誘導体が天然に存在していることの報告があるかどうか、解析を進める。また、膜貫通サブユニットについては、まだ目的タンパク質を大量に得る手法を確立できていない。そのため、ホモログを用いる、変異体を作成、スクリーニングするなどを試みる。

Causes of Carryover

計画的に研究を進めたが、試薬などの価格の変動や、予定外の段階で問題解決に手間取っていることから予定額に対して使用額に差が生じた。この金額は、次年度に用いることでより多くの条件検討などに効率的に使用する予定である。