Lumichrome biodegradation mechanism in Rhodococcus sp. LC-2.

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05357
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 土肥 裕希 筑波大学, 生命環境系, 助教 (20705412)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ルミクロム / 放線菌 / 代謝 / プラスミド / ビタミン

Outline of Annual Research Achievements

リボフラビンは植物や微生物によって生産される水溶性ビタミンであり、自然界に広く存在する。生体から自然環境中に放出されたリボフラビンは光分解などを受けて容易にルミクロムとなるが、生じたルミクロムの環境動態は明らかにされていない。本研究では、ルミクロム分解能を有する放線菌Rhodococcus sp. LC-2株のルミクロム分解機構を解明することで、環境中におけるルミクロムの微生物分解経路を明らかにすることを目的としている。
ルミクロム存在下で転写量が大きく上方制御された遺伝子クラスターにおいて、ルミクロムの分解代謝への関与が示唆された酵素タンパク質をコードした7つの遺伝子の遺伝子破壊株の作製にそれぞれ成功した。これら遺伝子破壊株のほとんどはルミクロム分解能を失ったことから、これらの遺伝子クラスターにコードされた酵素タンパク質がルミクロム分解に関与していることが明らかになった。
LC-2株の全ゲノムDNA配列を明らかにした結果、上述の遺伝子クラスターは本菌株が有する線状プラスミドにコードされていたことが示された。このことは、LC-2株のルミクロム分解能がプラスミドによって後天的に獲得されたことを示唆しており、Rhodococcus属にルミクロム分解能が保存されていないという結果と一致した。
LC-2株のルミクロム分解産物をHPLCおよびLC/MSによって解析した結果、ルミクロムの水酸化物と思われる化合物（分子量＋16）が新たに検出された。さらに、当該化合物の分解産物を思われる化合物も検出されていることから、ルミクロム分解は水酸化反応を経て分解代謝されていく可能性を新たに見出した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

トランスポゾンを用いたランダム変異株作製法の代わりに相同組み換えによる遺伝子破壊株作製法を用いたことで、Rhodococcus sp. LC-2株のルミクロム分解を担う遺伝子（群）の同定に成功した。一方で、本菌株のルミクロム分解遺伝子の転写制御機構については解析が進んでいない。

Strategy for Future Research Activity

作製したRhodococcus sp. LC-2株の各遺伝子破壊株のルミクロム代謝物、より具体的には細胞内外に蓄積されるルミクロムの分解中間体を順次同定し、それを破壊した遺伝子にコードされている酵素タンパク質の機能と照合させていくことで、ルミクロムの分解代謝経路を同定する。
ルミクロム存在下で転写量が大きく上方制御された遺伝子クラスターには転写制御因子をコードした遺伝子が含まれていたことから、その組換えタンパク質を用いて、基質（ルミクロム）やDNAへの結合性などを確認したのち、その制御機能を検証する。

Causes of Carryover

コロナの影響で全ての学会がオンラインとなり、旅費が不要となった。また、目的遺伝子の検出・同定をトランスポゾンによるランダム変異株作製法から相同組み換え法に変更したことから、必要な消耗品量に差異が生じた。ルミクロム分解の中間代謝物の同定に必要な各化合物の標品は総じて市販されていないことから、それらの受託合成への使用を計画している。また、最終年度は、論文だけでなく、学会（現地開催）で多数の発表を予定していることから、論文掲載費や学会発表にかかる旅費および参加費等に使用する。