2022 Fiscal Year Research-status Report
Realization of super-efficient metabolism in the microalga Nannochloropsis using genome editing
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21K05365
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
藤江 誠 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 准教授 (20274110)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川崎 健 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 助教 (00510299) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | ナンノクロロプシス / ゲノム編集 / 脂質生産 / CRISPR-Cas9 / 炭酸脱水素酵素 / ジーンタギング / carbonic anhydrase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①2021年度までの研究で、ナンノクロロプシスのCarbonic Anhydraseをゲノム編集で改変し、 光合成能力と増殖特性の変化を解析してきた。CA3遺伝子について、CA3遺伝子の１アミノ酸置換株の取得に成功した。その生理特性を解析したところ高濃度のCO2通気に対して明確な耐性を示した。2022年度に取得した酸素電極型光合成解析装置で解析したところ光合成能力が強化されている可能性が示された。この変異がゲノム編集によることを確認するために、野生型遺伝子による相補を試みている。当初計画に加えて、C代謝のsink側に位置するUDP-Glucose合成遺伝子の破壊を試み、２種類のUDP-Glucose合成遺伝子をゲノム編集で破壊した。これらの破壊株の脂質蓄積能力を細胞生物学的な手法で解析したところ脂質蓄積が強化された可能性が示された。 ② マイクロプレートを用いてナンノクロロプシスを培養し、培養液を蛍光染色して細胞中の脂質含有量を蛍光プレートリーダーで高速定量する実験系を確立した。また、１回の形質転換で10,000株以上の規模のタギングライブラリーが構築可能になった。構築したライブラリーについて細胞中の脂質を蛍光染色することで、脂質含量変異株のスクリーニングを進めている。 ③ゲノム編集株のポジティブセレクションマーカー遺伝子として、FOAによるポジティブセレクションを可能とするorotidine-5-phosphate decarboxylase、及び、2-FAによるポジティブセレクションを可能とするアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT） の破壊を2021年度に継続して試みた。どちらも耐性コロニーの取得に成功したが、ほぼ全ての耐性株でゲノム編集は確認されず、スポンテニアスな変異で耐性が出現したと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①carbonic anhydraseに関する研究では、高濃度の二酸化炭素に耐性株の取得に成功し、解析を進めている。また脂質合成に関与するUDP-Glucose合成遺伝子のゲノム編集株を作成した。この株を解析したところ脂質蓄積能力が向上した可能性が示されている。
②マイクロプレートを用いた脂質蓄積に関する変異体の取得に関しては、培養条件・染色条件を改善し96穴プレートで大量解析可能な実験系を確立した。計画に従ってタギングライブラリーを用いて脂質合成変異株のスクリーニングを進めている。
③ポジティブセレクション系の確立にはいたっていないが、代替としてRNPを直接導入してゲノム編集する系の構築に成功した。2022年度においては、ノックイン株の取得にも成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
①CA3変異株に関しては、光合成能力（酸素発生能力）を測定し、野生株と比較解析を進める。変異株に野生型のCA3遺伝子を導入して相補し、高濃度CO2耐性がCA3変異によることを確認する。UDP-Glucose遺伝子破壊株については、バイオマスあたりの脂質含有量とクリソラミナリン量を定量し、ゲノム編集により脂質高生産株を作出したことを確認する。②マイクロプレートを用いた培養・アッセイ系によるスクリーニング系を用いて、脂質合成変異株を取得する。③RNPの直接導入によるゲノム編集系の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
2022年度において研究実績に記載した①-③のうち、①についてはほぼ計画通りに実施し、重要な変異体の取得に成功した。②に関する研究は必要規模のタギングライブラリーを構築し、スクリーニングを開始した。当初は24穴マイクロプレートによるスクリーニングを予定していたが、実験系の改善により96穴プレートでのスクリーニングが可能となり、プラスチック器具等の消耗品費用が削減可能されたため残額が生じた。また、学会発表等で旅費の使用を計画していたが、オンラインでの開催となり旅費に関して残額が生じた。2022年度の残額については、2023年度に、スクリーニング規模を拡大するために利用する。
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