2021 Fiscal Year Research-status Report
抗真菌薬の標的となるα-マンノシド β-ガラクトフラノース転移酵素の機能解明
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21K05373
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
岡 拓二 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (50510690)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 糖転移酵素 / ガラクトマンナン / ガラクトフラノース / ガラクトフラノース転移酵素 / 細胞壁 / 糖鎖 / 糸状菌 / 抗真菌薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、病原性糸状菌Aspergillus fumigatus由来のMgfAからMgfFについて組換え酵素の発現および活性測定を行った。AfMgfAについては大腸菌の発現システムを用いることで培養液1L当たり2 mg以上の組換え酵素を得ることができた。Ni-アガロースカラムで精製したAfMgfAを用いて、4-メチルウンベリフェリル(4MU)-α-D-マンノース(Man)を受容基質としてガラクトフラノース(Galf)転移反応をさせた。酵素反応産物をHPLCにて分離・検出することで精製した。酵素反応産物を1H-NMRおよびメチル化分析に供することで構造を決定したところ、Galf-β-(1→6)-Man-α－4MUであることが明らかになった。すなわち、AfMgfAはα-マンノシド β-(1→6)-ガラクトフラノース転移酵素であることを明らかにすることができた。また、AfMgfAのパラログであるAfMgfBからAfMgfFについても少量ではあるが組換えタンパク質を得ることができた。Galf転移活性を検出したところ、すべての組換えタンパク質において活性が検出された。さらに、タンパク質の立体構造解明のために組換え酵素の大量調製を行い、30 mgの精製標品を得た。精製酵素を用いて196条件にて結晶化を試みたところ、数種類の結晶化条件でタンパク質結晶を得ることができた。来年度以降は、得られた結晶を基にタンパク質立体構造を明らかにすることを目指す。また、AfmgfAからAfmgfFまでの6重遺伝子破壊株を構築し、欠損糖鎖構造を明らかにすることでMgfが菌体内でガラクトマンナンの、どの部分の生合成を担っているのかを明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コロナ禍の影響により充分な研究時間を確保することができず研究の遅れが心配されたが、結果的に、当初の計画書に記載したスケジュールで研究結果を得ることができているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られた結晶を基にタンパク質立体構造を明らかにすることを目指す。また、AfmgfAからAfmgfFまでの6重遺伝子破壊株を構築し、欠損糖鎖構造を明らかにすることでMgfが菌体内でガラクトマンナンの、どの部分の生合成を担っているのかを明らかにする。ガラクトマンナンには真菌型ガラクトマンナン(FTGM)とO-マンノース型ガラクトマンナン(OMGM)がある。Mgfファミリータンパク質がFTGMとOMGMのどちらの生合成に関わっているのかを明らかにしたい。さらに、構築した多重遺伝子破壊株のマウスに対する病原性の変化についても検討する。
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