Identification and analysis of endogenous strong promoters in the extreme thermophile Thermus thermophilus using whole-genome shotgun approach.

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05376
• Research Institution: 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群)
• Principal Investigator: 平津 圭一郎 防衛大学校(総合教育学群、人文社会科学群、応用科学群、電気情報学群及びシステム工学群), 応用科学群, 准教授 (00294538)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 高度好熱菌 / プロモーター配列 / 転写 / シグマ因子 / ショットガンスクリーニング

Outline of Annual Research Achievements

Thermus thermophilus HB27株のゲノムDNA断片をレポータープラスミドに挿入したショットガンライブラリーを、10個用いてプロモータースクリーニング実験を行った。その結果、独立した326種類の高いプロモーター活性を示すクローンを単離した。これらのDNA断片の塩基配列を同菌株のゲノムデータと比較して推定遺伝子（ORF）の配置を確認すると、32クローンはDNA断片内及び近接するORFが全てレポーター遺伝子と逆方向であり、偽陽性と判断した。これらを除いた294クローンは、220種類のORF上流のプロモーター領域を含む可能性が高いDNA断片であり、そのうち162種類は単独のクローンだが残りの132クローンは複数重複した領域で58種類のORF上流領域を含んでいた。
この58種類のORFの上流領域は、重複したゲノムDNAの断片長および切断部位が異なっていても高いプロモーター活性を示すことから、最も信頼性の高い陽性クローンと考えられる。そこでこれらORF上流の非コード領域の塩基配列を解析した結果、34種類はσ70型の認識共通配列全体と類似した塩基配列が含まれていた。また、13種類は-10配列のみと、1種類は-35配列のみと、それぞれ類似の塩基配列が含まれていた。σ70型の共通配列と全く類似性の無いものは10 種類あり、その非コード領域は9～10塩基と短い場合の他に、最長で56塩基のものがあった。σE型の認識共通配列は多様性が高いので今後の詳細な配列解析が必要だが、上記の10種類には類似性は観られなかった。これらの結果は、T. thermophilus の高発現プロモーターの約6割はσ70型の認識共通配列を有するが、その一部の配列のみ有する場合や、σ70型およびσE型の認識共通配列を含まないにもかかわらず高い転写活性を示すプロモーターが合計4割程度存在することを示唆した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

平均長0.75 kbpのゲノムDNA断片をレポータープラスミドに挿入したライブラリーでは、ゲノム全長（約2 Mbp）を双方向にカバーする場合（カバー率 = 1）は5333クローンが必要である。事前の検証実験の結果から、本実験計画全体のスクリーニングの目安をカバー率 = 3相当の1万6千クローンと設定し、その結果は約200種類の高発現プロモーター領域が同定されると推定した。また同様に検証実験のスピードから、実験計画初年度には既存の約1500クローンから成る20個のライブラリーのうち、カバー率 = 1相当の4個のライブラリーのスクリーニング実験を行い、カバー率に対する高発現プロモーター領域の同定数を把握する事を目標とした。これに対して現状では、補助金による実験キットの購入と実験手順の見直しで飛躍的にスクリーニング実験の速度が高まり、実験計画全体のスクリーニングの目安とほぼ同じ10個のライブラリーのスクリーニングが遂行できており、その結果、推定値に近い220種類のORF上流領域を含むDNA断片を同定した。これらのうち偽陽性を含まないと考えられる58種類のORFの上流領域の塩基配列を解析した結果、T. thermophilus の高発現プロモーターの約6割はσ70型の認識共通配列との類似性を有するが、その一部にしか類似性がない場合や、σ70型およびσE型の認識共通配列と類似性が無いにもかかわらず高い転写活性を有するプロモーターが合計4割程度存在する可能性を示した。
本研究の目的は、T. thermophilus特有のプロモーター構造、ゲノム構造の実態を解明し、ゲノム情報を高度に活用するための知的情報基盤の構築へと繋げることであり、その特徴を示すプロモーター候補をスクリーニング実験の効率化で取得できたことにより、上記に示す進捗状況の区分と判断をした。

Strategy for Future Research Activity

事前の検証実験の結果から、本実験計画全体のスクリーニングの目安をゲノム全長のカバー率 = 3に相当する1万6千クローンと設定し、その結果は約200種類の高発現プロモーター領域が同定されると推定した。現在、目安とほぼ同じ10個のライブラリーのスクリーニングを終了し、推定値に近い220種類の高発現プロモーター領域を含む可能性が高いDNA断片を同定した。しかし、162種類のORF上流領域を含むクローンが単独でしか得られていないことや、現在もスクリーニングしたライブラリー数の増加に伴い新規の陽性クローンが得られていることから、スクリーニングはまだ飽和していないと判断できる。従って、今後は以下の年次計画で研究を進めていく。
「令和4年度前半～」：既に作製済みの残り10個のライブラリーに対して、飽和度を評価しながら引き続きスクリーニングを進めていく。1つのORFに対してゲノムDNAの断片長および切断部位が異なっても高いプロモーター活性を示す重複クローンは、最も信頼性の高い陽性クローンと考えられるため、新規に重複するクローンが増加する頻度も評価しながら使用するライブラリー数を判断する。実験計画初年度に実験工程を改良して飛躍的にスクリーニング速度が高まったことから、10個すべてを用いたとしても当該年度内にはスクリーニングは終了すると予測される。
「令和4年度後半～令和5年度」：単離した各DNA断片の塩基配列情報を順次解析して正確な遺伝子とプロモーター位置の推定を行い、各シグマ因子のプロモーター共通配列との類似性の有無によりDNA断片を分類する。類似性の無いもののうち、特に重複してクローンが得られたDNA領域を優先して、さらに塩基配列解析や実験的なプロモーター位置の同定を行い、これらのデータを集約してT. thermophilus特有のプロモーターと遺伝子の構造の解明を試みる。

Causes of Carryover

生じた次年度使用額は契約余剰金であり、翌年度分の請求助成金額の1％相当と少額であることから、使用計画は従来通りで変更の必要はない。