2022 Fiscal Year Research-status Report
Structural analysis of cFLIP as an iron-binding protein and elucidation of a new physiological function
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21K05380
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
酒巻 和弘 京都大学, 生命科学研究科, 准教授 (20271017)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
富井 健太郎 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 情報・人間工学領域, 研究チーム長 (40357570)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 鉄結合タンパク質 / Fenton反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、大腸菌よりcFLIPのリコンビナント-タンパク質の精製と、リコンビナントを使った生化学的解析を中心に進めた。初段階から単一タンパク質としての精製は困難であることが判明したため、MBPとの融合タンパク質として改良を施すことで結果として精製が可能となった。精製したリコンビナントを使ってFenton反応への抑制効果の有無を調べたところ、抑制作用が認められた。また、cFLIPを発現する大腸菌は、コントロールの細胞に比べて過酸化水素水に対して耐性を示すことが明らかとなった。一方、システイン残基(Cys259)をアラニンに置換したcFLIP変異体を発現する大腸菌の場合は、耐性を失うことも認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
【リコンビナント-タンパク質の精製について】
単一タンパク質として単離・精製するのではなく、MBPとの融合タンパク質として単離・精製する工夫を施すことにより、タンパク質の凝集や分解を抑制することに繋がり、生化学的解析に用いることができる収量を得ることが可能になった。
【生化学的解析について】
上述の精製リコンビナントを使ってFenton反応の抑制効果を調べたところ、予め期待した通りの結果を得ることができた。
【細胞学的解析について】
In vitroの結果と同様に大腸菌を使った実験においても、cFLIPが存在することで過酸化水素による酸化作用に対して大腸菌が耐性を示すことを見い出せた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 生化学的解析によるcFLIPの特質の解明
本研究の主目的の一つ、cFLIPが鉄結合タンパク質であることを生化学的手法によって明らかにする。
2. FLIPの新規機能の証明
培養細胞を用いて、cFLIPがフェロプトーシスによる細胞死を抑制できることを新たに立証する。そして偽プロテアーゼと定義されているcFLIPが進化に伴い新たな機能を獲得したことを示唆する。
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| Causes of Carryover |
令和3年度（初年度）は、コロナ禍により研究が一時中断したことで消耗品の出費が大きく減少し、学会への参加を控えたこと等により見積額より少ない予算で一年を終えた。残った予算を翌年（令和４年度）に繰り越したことにより、当初の見積額よりも多めの予算となったために、令和４年度においても余剰予算となった。
令和５年度は、継続して実験補助のために１名を雇用予定であり、その費用を前年度の残金から「人件費」として賄うつもりである。
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