2021 Fiscal Year Research-status Report
細胞内管状膜構造の形成と機能に関与するABCタンパク質の役割
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21K05381
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
永田 紅 京都大学, 農学研究科, 研究員 (70401213)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ABCタンパク質 / 細胞内管状膜構造 / ABCC6(MRP6) / ATP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜は細胞表面を覆うだけでなく、ときに細胞内部に深く陥入し、管状の膜構造（tubule構造）を形成する。しかし、細胞がなぜ自らの内部にこのような管状膜構造をもつのか、その生理的意義については不明な点が多い。本研究は、ABCタンパク質(ATP-binding cassette proteins)を手掛かりとして、細胞内管状膜構造の形成機構と生理的意義を明らかにしようとするものである。
令和3年度には、管状膜構造に局在するABCタンパク質ABCC6(MRP6)に着目した実験を行った。ABCC6は弾性線維性仮性黄色腫の原因遺伝子産物であり、ATP加水分解依存的に細胞外へのATP排出を促進することが知られている。GFP融合ABCC6を安定的に発現するHeLa細胞を樹立したところ、野生型ABCC6安定発現細胞において細胞外へのATP排出が促進され、ATP加水分解活性をもたない変異型ABCC6安定発現細胞では細胞外へのATP排出が促進されないことを確認した。一方、野生型ABCC6も変異型ABCC6も細胞内管状膜構造に局在したことから、ABCC6のATP加水分解活性は、管状膜の形成やABCC6の管状膜への局在化には必要ないことが示唆された。ABCC6はBARドメインタンパク質のひとつPACSIN2 (Syndapin2) や、tubular recycling endosomeマーカーであるRab8、MICAL-L1と一部共局在し、既存の膜構造に局在することが示唆された。ABCC6のほかに、ABCB1(MDR1)やMRP1(ABCC1)も細胞内管状膜構造に局在した。
さらに、ABCC6依存的に管状膜構造内腔へ排出されたATPを評価するために、ATP可視化プローブを管状膜上に局在化させることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
【研究実績の概要】において述べたように、令和3年度には主に弾性線維性仮性黄色腫の原因遺伝子産物ABCC6(MRP6)に注目した研究を行った。その結果、ABCC6がATP加水分解活性依存的に細胞外へのATP排出を促進することを確認した。また、野生型ABCC6もATP加水分解活性をもたない非機能性ABCC6もともに細胞内管状膜構造に局在することから、ABCC6のATP加水分解活性は管状膜の形成およびABCC6の管状膜への局在化には必要ないことが示唆された。蛍光色素FM4-64や蛍光標識デキストランを用いた実験から、ABCC6の局在する管状膜は細胞膜と連続していること、管状膜構造内腔は細胞外へ開口していることが明らかになった。またこの管状膜構造がアクチン繊維にそって配置し、低浸透圧処理によって管状膜構造が崩壊するなど、ABCC6の局在する細胞内管状膜構造についての新たな知見を得た。現在、論文投稿準備中である。
さらに、ATP可視化プローブを管状膜上に局在化させることに成功し、細胞内管状膜構造の内腔がプリン作動性シグナル伝達のリガンドとしてのATPを局所的に高く留めおき、シグナル伝達を効率的に行うための場となっているという仮説を検証する準備が整った。以上、研究は当初の計画以上に進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
【管状膜構造内腔のATP可視化】細胞内管状膜構造の生理的意義を明らかにするため、ABCC6(MRP6)依存的に管状膜構造内腔へ排出されたATPを可視化し、細胞表面におけるATP濃度と比較する。
【管状膜構造近傍のカルシウムイメージング】カルシウムセンサーGCaMPを利用し、ATPをリガンドとしたプリン作動性シグナル（カルシウム波）が管状膜構造を起点として伝わるかどうかを検証する。
【ABCC6の1分子観察】全反射照明蛍光顕微鏡を用い、平面細胞膜上および管状膜構造上におけるABCC6分子の挙動を比較し、また多量体化の有無を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
令和3年度は、令和2年度に引き続き新型コロナウイルス感染拡大のため世界的に試薬や消耗品の発注や納期にも影響が及び、物品購入が制限されたため。また、当初予定していた海外の学会への参加を見送ったため。このために生じた次年度使用分の助成金は、試薬や消耗品の購入に使用する計画である。
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