2022 Fiscal Year Research-status Report
植物におけるビタミンB2代謝調節機構とその生理的意義の解明
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21K05382
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| Research Institution | Shimane University |
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Principal Investigator |
小川 貴央 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 准教授 (80603802)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ビタミンB2 / リボフラビン / 輸送体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ビタミンB2であるリボフラビンを前駆体とするFADやFMNは、生物のあらゆる生理機能に重要な補酵素であるため、細胞内レベルは恒常的に維持されている。植物においてリボフラビンは葉緑体のみで合成され、各オルガネラに輸送された後にFADやFMNが合成されると考えられる。しかしながら、これらフラビン化合物のオルガネラ間、また植物の組織間における輸送機構については全く不明である。そこで我々は、シロイヌナズナにおけるフラビン化合物の輸送体を同定するために、ある輸送体ファミリーに注目して解析を行ってきた。まず、複数の遺伝子から構成される輸送体ファミリー遺伝子の中で、フラビン化合物輸送体が存在するかどうかを検討するために、低濃度のフラビン添加条件下では生育できない酵母変異体にこれら輸送体遺伝子を形質転換し、その生育を調べた。その結果、2種類の輸送体遺伝子導入株において、低濃度フラビン添加条件でも生育可能にまで回復することがわかった。そこで、それらの輸送体導入酵母を用いて、フラビン輸送活性を調べた結果、両方の輸送体候補遺伝子導入株においては、顕著なフラビン取り込み活性が認められた。このことから、同定した2種類のフラビン輸送体候補遺伝子は、少なくとも酵母内ではフラビン輸送体として機能することが明らかになった。そこで現在、これら候補遺伝子が実際に植物細胞内においてもフラビン輸送体として機能しているかについて、シロイヌナズナT87培養細胞や、植物体を用いて詳細な解析を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
フラビン化合物代謝調節に関与する新規転写因子FRTF19の生理機能解析
昨年度までに、トランスクリプトーム解析および遺伝子破壊株を用いた解析により同定した新規転写調節因子FRTF19とフラビン生合成系遺伝子群のストレス応答性について解析を行ってきた。本年度は、野生株およびFRTF19遺伝子破壊株でFRTF19を恒常的に過剰発現させた形質転換体を作出し、解析を行なった。野生株でFRTF19を過剰発現させた株においては、コントロールよりも高い細胞内フラビン化合物レベルを示した。また、FRTF19遺伝子破壊株で見られた細胞内フラビン化合物レベルの減少は、FRTF19の過剰発現により回復した。さらに、FRTF19過剰発現株を用いて高温、凍結耐性について解析を行なった結果、FRTF19過剰発現株はストレス耐性を示さなかった。一方、アブシジン酸処理に対してはFRTF19過剰発現株は野生株と比較して非感受性を示し、FRTF19遺伝子破壊株は感受性を示した。
フラビン化合物輸送体の生理機能解析
リボフラビン要求性酵母変異体を用いたスクリーニングにより、フラビン化合物輸送体候補として単離した2種類のPurine permease (PUP)について、同様の出芽酵母を用いたフラビン化合物輸送活性を評価した。その結果、PUP-a導入株ではリボフラビン添加2分後から速やかなリボフラビンの取り込みが認められた。一方、PUP-b導入株ではリボフラビン添加後12時間で、細胞内フラビンの増加が認められたが、短時間でのリボフラビンの取り込みはほとんど認められなかった。したがって、PUP-bよりもPUP-aのほうが高い輸送活性を示すことが示唆された。そこで現在、これら2種類の輸送体を過剰発現させたシロイヌナズナT87培養細胞およびシロイヌナズナ植物体を作出し、さらに詳細な解析を行なっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現段階では大きな遅れもなく、研究計画通りに進捗している。したがって、今後は当初の予定通り以下のように研究を進めていく。
フラビン化合物代謝調節に関与する新規転写因子FRTF19の生理機能解析
植物細胞内フラビン化合物量と環境ストレス応答との関連性を検討するために、リボフラビン合成系遺伝子群の過剰発現/抑制発現株の作出を進めている。実際に細胞内リボフラビン量が数倍に増加した形質転換体が得られており、これらの形質転換株を用いて種々のストレス感受性などについても解析を進めている。さらに、作出したいくつかの形質転換体においては、フラビンの高蓄積以外にも興味深い表現型が示すものも得られており、これについても解析を進める予定である。
フラビン化合物輸送体の生理機能解析
フラビン化合物輸送体候補について、植物細胞内における生理機能を評価するために2種類のPUP遺伝子についてシロイヌナズナT-87培養細胞を用いた過剰発現株の作出を行なっている。現在PUP-aについては過剰発現株の作出が完了しており、フラビンの取り込み活性を検討したところ、酵母と同様に植物細胞においてもPUP-aがフラビン輸送活性を示すことが確認できている。今後PUP-bについても同様の解析を進めていく。さらに植物培養細胞と並行して、シロイヌナズナの遺伝子破壊株の単離が完了しており、今後過剰発現株と合わせてこれら輸送体の生理機能について解析を進める。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍により一部の学会がオンライン開催となり、旅費に差額が生じたため。
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