細胞外小胞への選択的・効率的なタンパク質輸送系構築

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05385
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 柴田 俊生 九州大学, 理学研究院, 助教 (00614257)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 脂質修飾 / 細胞外小胞 / EV / トランスグルタミナーゼ

Outline of Annual Research Achievements

タンパク質は脂質修飾が施されることにより、その細胞内局在や機能が変化することが知られている。本研究では脂質修飾されることで細胞外小胞（EV）として細胞外へと分泌されるトランスグルタミナーゼ（TG）をモデルとし、脂質修飾依存的なタンパク質分泌機構を解明するとともに、TGの分泌の仕組みを他タンパク質へ応用することを目指した。当該の年度では細胞内輸送や脂質の代謝に関わるタンパク質の変異体を用いた実験により、脂質修飾とEVへの輸送機構を明らかにするとともに、高効率にタンパク質がEVへ輸送される配列を見出した。分泌されたEVは血流やリンパ液に乗り、遠隔の器官に情報を届ける細胞間情報伝達に関わるため、生理活性タンパク質の輸送体としても着目されている。本成果で見出された分泌機構を応用することで、様々なタンパク質の高効率なEVパッケージングと機能発揮に効果が期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

まず、脂質修飾依存的な高効率分泌配列を決定した。TGのように脂質修飾を施されるタンパク質をデータベース上よりスクリーニングし、2種のタンパク質を同定することができた。これらの配列を元に種々のアミノ酸に置換したところ、高効率に細胞外小胞として細胞外に分泌されるN末端のアミノ配列を見出すことができた。この配列を緑色蛍光タンパク質に付加して発現させた結果、オリジナルのTG-A配列より5倍以上の分泌効率を示した。次に、脂質修飾によるEVへの輸送機構を調べた。細胞外小胞の形成と分泌にはendosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) もしくはスフィンゴ脂質であるセラミドが関与することが知られている。そこで、培養細胞にESCRT構成遺伝子のノックダウンやスフィンゴミエリン分解にかかわる酵素の阻害剤を添加した。その結果、TG-Aの分泌量が有意に減少することが判明した。また、細胞から分泌されるエクソソーム中のタンパク質を網羅的に解析したところ、スフィンゴ脂質代謝経路にかかわる酵素が多く含まれていた。本遺伝子の過剰発現やノックダウンではTG-Aの分泌に有意な変化は認められなかったが、過剰発現させた細胞EVでは、多細胞への取り込みが促進した。

Strategy for Future Research Activity

これまでに脂質修飾を介した細胞外分泌の機構と高効率分泌配列の探索が概ね完了することができた。今後はこの配列をタグとして様々な生理活性タンパク質に融合させ、その分泌やその活性を評価したい。同時に多細胞への取り込みが促進された遺伝子の過剰発現も行い、活性増強へ与える影響を調べたい。また今後は、脂質修飾の他の機能、特に免疫との関連について探索を行う予定である。現在は脂質修飾遺伝子のノックダウンや阻害剤を用いて、生体への細菌感染時の影響も調べている。