2022 Fiscal Year Research-status Report
生体認識配糖体生産のための特異的糖鎖遊離酵素の新規ドメイン解析とその機能開発
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21K05396
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
伊藤 和央 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (20183171)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 生体認識配糖体 / エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ / 立体構造 / ドメイン / マルチドメイン構造 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2021年度は、N末端側のTM領域を欠いた野生型エンドHS（Wild）とそのC末端側から順次欠失した6種類の欠失変異型エンドHS（DM-1～DM-6）の発現系を構築した。各発現酵素のアミノ酸領域は、Wild（30～1009）、DM-1（30～966）、DM-2（30～906）、DM-3（30～883）、DM-4（30～861）、DM-5（30～811）、DM-6（30～708）である。
本年度は、各発現系の発現条件を検討した。その結果、10μM IPTG添加による発現誘導下、20℃において20時間の培養によって1リットルの培養液の菌体に、400～2500 mgの野生型あるいは欠失変異型エンドHSが発現した。
発現した各欠失変異型エンドHSについて、2本鎖コンプレックス型糖鎖を結合しているヒトトランスフェリンからの糖鎖遊離活性を野生型酵素の活性と比較した。その結果、欠失変異型酵素DM-1とDM-2の活性は野生型酵素の活性と同程度であった。一方、DM-3、DM-4、DM-5およびDM-6からは活性が検出されなかった。また、ハイマンノース型糖鎖を結合しているウシリボヌクレアーゼからの糖鎖遊離活性は野生型および欠失変異型酵素いずれからも検出されなかった。
DM-1とDM-2は、エンドHSの構成ドメインI～VのうちドメインVを部分的あるいはすべて欠失している。これらは野生型酵素と同程度の活性を示すことから、ドメインVはエンドHSの活性には関与しないものと考えられた。一方、DM-3とDM-４はドメインIVを部分的に欠失し、DM-6はすべて欠失しドメインI、IIおよびIIIのみから構成されている。このため、エンドHSの活性発現にはドメインIVの存在が必須で、触媒領域が存在すると考えられるドメインIおよびドメインIIとIIIが構成する構造ではエンドHSの活性は発現しないものと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、コロナ禍のため研究時間が制限され、予定していた研究をすべて行うことができなかった。しかし、野生型エンドHSおよび6種の失失変異型エンドHSの大腸菌での発現条件を検討することができた。その結果、野生型エンドHSおよび欠失変異型エンドHSを400～2500 mg/リットル培養液の高発現量で発現することができた。
さらに、発現し欠失変異型酵素の糖タンパク質からの糖鎖遊離活性を検証し、エンドHSを構成するドメインI～VのうちドメインVを欠失しても酵素活性には影響しないが、ドメインIVを部分的あるいはすべて欠失すると活性は発現しなくなること明らかにした。そして、ドメインVはエンドHSの機能発現には関与しないが、ドメインIVは本酵素の活性発現に必須であると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究によって構築した野生型エンドHSおよび欠失変異型エンドHSの発現条件をもとに、各変異酵素を大量発現しこれらを精製する。精製した欠失変異型エンドHSを用いて、様々な構造の糖鎖を結合する糖タンパク質からの糖鎖遊離活性と糖鎖転移活性における酵素反応動力学的解析を行う。また、変異酵素と糖鎖との分子間相互作用を解析する。さらに、ドメイン間のループ構造を特異的プロテアーゼで加水分解し、各ドメイン欠失エンドHSを調製し、同様の解析を行う。こうして各ドメインの機能を明らかにする。
また、得られ欠失変異型エンドHSの結晶化条件を検討し、得られた結晶を用いてX線結晶構造解析を行い、欠失変異型エンドHSの立体構造とその糖鎖構造特異性との関係から、エンドHSのドメインの機能を明らかにする。
さらに、基質糖タンパク質と野生型および欠失変異型エンドHSとの共結晶を調製し、X線結晶構造解析によってエンドHS・基質複合体の立体構造を明らかにする。そして、触媒および糖鎖認識関与するアミノ酸残基を特定し、各ドメインの機能を解明する。
一方、エンドHSのドメイン解析から特定した加水分解・糖鎖転移に関わるアミノ酸残基を置換し糖鎖転移合成型エンドHSに改変し、ヘスペリジンおよびブレオマイシンに糖鎖を転移導入する。糖鎖結合ヘスペリジンおよびブレオマイシンのマウス肝臓への特異的移行を調べる。また、糖鎖転移合成エンドHSを用いて抗リウマチ抗体医薬品トシリズマブなどのバイオ医薬品の糖鎖を入替えと糖鎖構造最適化を検証する。
さらに、エンドHSの構成ドメインをハイマンノース型糖鎖特異的エンドＦＶ遺伝子に挿入し、ハイブリッドエンドＦＶの糖鎖構造特異性を調べ、ドメイン機能を検証する。
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| Causes of Carryover |
今年度はコロナ禍による研究制限があったため、計画していた研究を予定どうり遂行することができず、使用した試薬や実験器具の量が減った。このため、これらの購入に充てる経費が少なくなり、次年度使用が生じた。
これは、次年度に欠失変異型エンドHSの精製と糖タンパク質からの糖鎖遊離活性と糖鎖転移活性における酵素反応動力学的解析や、変異酵素と糖鎖との分子間相互作用の解析に充てる。さらに、特異的プロテアーゼを利用したドメイン欠失エンドHSの調製とその機能解析に利用する。また、欠失変異型エンドHSの結晶化とそのX線結晶構造解析による立体構造の解明のために利用する。さらに、基質糖タンパク質と野生型および欠失変異型エンドHSとの共結晶のX線結晶構造解析に充てる。
さらに、エンドHSの糖鎖転移合成型エンドHSへの改変とこれを用いた生体認識ヘスペリジンおよびブレオマイシンの合成の検証実験に利用するとともに、バイオ医薬品の糖鎖を組換え糖鎖構造最適化の検証ために用いる。また、エンドHS構成ドメインをもつハイブリッド酵素の作製とその糖鎖認識機能の検証のために利用する。
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