非大腸菌タンパク質生産系を併用したモジュラーポリケチド合成酵素の試験管内再構成

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05404
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 湯澤 賢 慶應義塾大学, 政策・メディア研究科(藤沢), 特任講師 (20843890)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ポリケチド合成酵素 / 生化学 / 試験管内再構成 / 非大腸菌タンパク質生産系 / 巨大酵素

Outline of Annual Research Achievements

モジュラーポリケチド合成酵素（モジュラーPKS）は多様な薬剤の基本骨格の生合成を担う巨大酵素である。モジュラーPKSの生化学的解析や構造生物学的解析は新規薬剤の創出につながる可能性があるため、過去20年に渡り研究が行われている領域である。モジュラーPKSはその大きさ故、野生型酵素のin vitro解析は容易ではなく、これまで試験管内再構成を達成した例は世界でまだ1例しかなく、至適温度、至適pH、至適イオン強度、kcat、KM等の基本的な情報が一般にどんな分布を示すかは明らかになっていない。本研究では、これまで利用されていない非大腸菌タンパク質生産系も併用し、新たに数種類の野生型モジュラーPKSの試験管内再構成およびそれらの生化学的解析を実施することを目的としている。第一のモジュラーPKSに関しては、非大腸菌タンパク質生産系を併用することで試験管内再構成にすでに成功している。現在は引き続き、至適温度、至適pH、至適イオン強度、kcat、KM等の解析を進めている。本成果は未発表であるが、世界で2例目の野生型酵素の試験管内再構成の成功例になり得る。また国内では初の成果となり得る。第二のモジュラーPKSに関しては、プラスミド構築に苦戦しており、まだタンパク質精製の段階に至っていない。初年度の実施報告で述べた第三の系に関して2年目は精力的に研究を進めた。この第三の系は、モジュラーPKSと非リボソーム型ペプチド合成酵素とのハイブリッドの系である。第三の系では計10種類の酵素が再構成には必要であり、これまで７種類に関しては大腸菌を用いたタンパク質生産系で得ることに成功している。一方で残りの３種類に関しては大腸菌ではごく少量のみ、あるいは全く生産されないケースもあった。現在は我々が保有する非大腸菌タンパク質生産系を活用して、残り数種類の酵素の生産を試みている段階である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

モジュラーPKSは複数の巨大酵素から構成されており、通常の酵素と比較してタンパク質の取り扱いは容易ではない。担当する学生は博士課程に進学し、さらに技術を向上させており、最終年度には試験管内再構成の成功例を複数実現させたい。一方で第二の系、第三の系は試験管ない再構成の目処が立っているとは言い切れない。交付申請書には２、３年目には第二の系に挑戦することを掲げており、遅れているとは言えないが、概ね順調に進展しているとも言い切れない。

Strategy for Future Research Activity

第一の系に関しては現時点でも論文発表は可能であるが、論文の質をさらに高めるため、より多くの実験データを集めていることに焦点を当てている。第一の系を活用して天然物のアナログを多数生産し得ることも確認している。一方で、当初は天然物アナログの精製、生物活性試験も含めた論文にする予定であったが、アナログの収量の向上や定量が容易ではなかったため、試験管内再構成に焦点を当てた論文を執筆し発表する予定である。第二、第三の系に関しては、最終年度ということもあり、どちらか成功率が高そうな系に標的を絞って実験を進める予定である。現在の研究の進捗から考えて、夏前には意思決定をする。第二、第三の系に関しても試験管内再構成に成功すれば第一の系と同様の内容での論文執筆を検討している。