2022 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of the effect of extracellular stearic acid on intracellular transport

Research Project

Project/Area Number	21K05427
Research Institution	Teikyo University
Principal Investigator	厚味厳一帝京大学, 薬学部, 教授 (70276608)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	石橋賢一帝京大学, 薬学部, 助教 (00707458)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	ステアリン酸 / リン脂質 / 細胞内輸送 / Akt / GLUT4
Outline of Annual Research Achievements	細胞外のステアリン酸の濃度変動が、細胞内の小胞輸送に与える影響を明らかにすることを目指してる。2022年度では、研究を進める上で鍵となる細胞内の小胞輸送の可視化に向けて検討した。AKTタンパク質に緑色蛍光タンパク質EGFPが付加されたタンパク質を発現するプラスミドベクターを作成し、細胞内のAKTタンパク質を可視化するツールを得た。また、遺伝子導入が困難である脂肪細胞に対して遺伝子導入条件を検討し、導入効率を高めることが出来た。次に、ステアリン酸がどのように細胞内輸送に関わるのかを明らかにするために、細胞内のステアリン酸量とインスリン応答性との関係を調べた。その結果、細胞外のステアリン酸濃度が継続的に高まることで、細胞内のステアリン酸の含有量が高まるだけではなく他の脂肪酸の含有量にも変化が生じ、その変化とインスリン応答性低下とのタイミングが一致することが分かり、ステアリン酸以外の脂肪酸の細胞内における変動にも着目する必要があることが明らかになった。さらに、ステアリン酸と立体構造が類似しているが二重結合を分子内に有するバクセン酸を用いて検討したところ、細胞外のステアリン酸の濃度を高めた時とは異なり、インスリン応答性は低下しなかった。この結果からも、単に細胞内でステアリン酸のような脂肪酸が増えただけではインスリン応答性が低下しない、すなわち細胞内輸送が影響を受けないことを示唆しており、ステアリン酸以外の脂肪酸の含有量の変化も併せて総合的に解析を進めていく必要性が強く示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason タンパク質を発現させるためのプラスミド作成が予定通りに進まずに、作成方法を再度検討して変更した。そのために、遺伝子組み換え申請を再度行ったために、時間を要した。
Strategy for Future Research Activity	細胞内の小胞輸送の可視化を優先的に進める。AKTやGLUT4にEGFPが付加されたタンパク質を細胞に発現させることが可能となったため、試薬の培養液への添加や温度制御を行うことで細胞内輸送の速度を調節し、細胞外のステアリン酸の濃度が高まることで細胞内小胞輸送のどの段階が影響を受けているのかを明らかにする。また、細胞分画法と組み合わせ、細胞外のステアリン酸の濃度が高まった際に、細胞内のどこの、どのリン脂質分子種の含有量が変化するのかを明らかにする。さらに、含有量に変化が見られたリン脂質分子種の合成に関わる酵素の発現量を遺伝子組換え実験により調節し、細胞内小胞輸送とリン脂質分子種の含有量の変化との因果関係を示す。
Causes of Carryover	予定では、細胞内にプラスミドベクターを導入し、発現させたタンパク質の動きをみる予定であったが、プラスミドベクターの作成に時間を要したため、細胞培養などの経費が少なかった。また、成果を発表する予定の学会への参加も見合わせた為、次年度使用額が生じた。翌年度は、細胞培養や遺伝子導入などに費用を要するため、繰り越した額を使用する予定である。