糖化ストレス誘導性エクソソームを介した骨機能阻害における食用植物成分の効果

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05432
• Research Institution: Shizuoka Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 高部 稚子 静岡理工科大学, 理工学部, 准教授 (00436594)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 糖化ストレス / 骨代謝異常 / 食用植物

Outline of Annual Research Achievements

糖分とタンパク質との非酵素的な反応である糖化反応は血液中をはじめ全身で起こり、結果、様々な終末糖化産物(AGEs)を産生する。AGEsの蓄積はタンパク質の機能不全や炎症惹起に関わることから、近年、疾病予防のターゲットとされてきた。一例として、血中AGEs濃度が高い糖尿病患者は骨折の罹患率が高いことが知られている。骨は通常、骨芽細胞による骨新生と破骨細胞による骨破壊のバランスが保たれており、このバランスが崩壊することによる骨質・骨量の低下は骨折の危険因子となる。このことから我々はAGEsによる骨代謝異常に着目し研究を行ってきた。これまでにAGEsが破骨細胞分化を抑制すること、分化に必須な転写因子の1つであるMicrophthalmia-associated transcription factor, isoform E (MitF-E)の発現を抑制すること、MitF-Eの発現抑制には細胞外分泌小胞であるエクソソームが関与することを示した。本研究ではエクソソームに含まれる小分子RNAであるマイクロRNA(miRNA)に着目し、破骨細胞前駆細胞の分化過程において細胞培養液中に放出されたエクソソームを分離・精製し、含まれるmiRNAについてマイクロアレイを用いた網羅的な解析を行った。その結果、AGEs添加の有無によりエクソソーム内のmiRNAの発現パターンが大きく異なることが明らかとなった。更にAGEs添加によりエクソソーム内で増加するmiRNAについてin silico解析を行い、MitF-EあるいはMitF-Eの発現制御に関わる転写因子のmRNAの制御に関わる可能性の高い14種類のmiRNAを見出した。real-time PCRによるデータの再現性を検証したところ7種類のmiRNAについて再現性が認められた。これらの強制発現ベクターの作製を行い、細胞内への導入条件を確立した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウスマクロファージ由来RAW264.7細胞がReceptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)により破骨細胞に分化する過程において、ヒト血清アルブミン(human serum albumin; HSA)とグルコースから作製したAGEsは分化を抑制する。この際、細胞培養培地からエクソソームを単離し新たなRAW264.7細胞にRANKLと共に加えると、AGEs非存在下においてもMitF-E及び破骨細胞分化マーカーの低下が認められた。AGEsあるいは糖を加えず加熱したHSA(加熱HSA)添加時に細胞培養液中に放出されたエクソソームをそれぞれ分離・精製し、含まれるmiRNAについてマイクロアレイを用い網羅的な解析を行った結果、加熱HSAに比べAGEs添加により2倍以上発現亢進したmiRNAが174種類、0.5倍以下に減少したmiRNAが203種類あった。In silico解析の結果、発現亢進を示したmiRNAのうちMitF-EあるいはMitF-Eの発現制御に関わるcAMP response element binding protein (CREB)の3’-UTRへの結合が予測されるmiRNAは14種類あり、real-time PCRによる再検証の結果、7種類のmiRNAに再現性が認められた。これらのmiRNAについてRAW264.7細胞から得られたゲノムDNAを鋳型とし、miRNA領域を含む約250bpsの配列をクローニングし、pmRZs-green1 vectorに挿入しmiRNA発現ベクターを作製した。Vectorの細胞内への導入効率はvectorが有する緑色蛍光(GFP)を蛍光顕微鏡で観察することで評価した。その結果、Lipofection法によるvectorのRAW264.7細胞への導入が認められた。

Strategy for Future Research Activity

前年度から引き続き、AGEs刺激により細胞外に放出されたエクソソームに含まれるmiRNAが破骨細胞分化過程に与える影響について詳細な検証を進める。具体的には、前年度に作製したmiRNA強制発現ベクター7種類を用い、lipofection法によりRAW264.7細胞に導入する。その後RANKL刺激により生じる破骨細胞分化過程において、これらのmiRNAの発現亢進が与える影響について、MitF-Eの発現レベルをreal-time PCR、破骨細胞分化マーカーであるtartrate-resistant acid phosphatase (TRAP)活性を比色法により評価する。
また作用機序については、miRNA強制発現ベクターとMitF-E、あるいはCREBの3’-UTRを組み込んだルシフェラーゼベクターを共発現させ、miRNAがこれらの遺伝子を発現制御するメカニズムについて詳細に検証する。
併せて本課題では、AGEs産生を抑制する（抗糖化）機能を有する食用植物に関する有用性の検証も目的としている。AGEs産生を抑制する化合物は研究が進められているものの、副作用のため日本では認可されていない。我々はこれまでに500種類以上の食用植物からAGEs抑制作用を有する抗糖化素材を見出し、それらの細胞・組織・生体への効果について検証を行ってきた。その中で見出した抗糖化素材であるヤーコン・紅蓼などは、その抽出物がAGEsにより生じるMitF-E発現の減少を回復する効果を持つことを明らかにしている。AGEsによる破骨細胞分化障害過程において、これらの植物抽出物がどのような作用機序で障害を抑制しているのかを明らかにすることで、将来的に目指す骨機能障害への予防につなげるための知見を得る。