2021 Fiscal Year Research-status Report
殺菌ストレスで発生する損傷菌の動態解析と予測モデリングの構築
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21K05489
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
朝田 良子 大阪府立大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (60546349)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古田 雅一 大阪府立大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (40181458)
坂元 仁 大阪府立大学, 研究推進機構, 客員研究員 (40570560)
土戸 哲明 大阪府立大学, 研究推進機構, 客員教授 (50029295)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 食品科学 / 微生物制御 / DNA損傷 / 細菌芽胞 / 損傷菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者らがこれまでE.coliなどの栄養細胞を対象として理論的に確立されている損傷菌計数法（差分後培養法：Differential Subculture法）をBacillus subtilis芽胞に適用し、さらに加熱殺菌と深紫外線殺菌により生じる損傷菌の検出への適用性を検討した。差分後培養法の対象法である発育遅延解析法（液体培養）では、加熱殺菌、深紫外線殺菌ともに、殺菌処理前後で希釈率と遅延時間の相関性に有意な差はなく、いずれの場合においても適用要件を満たすことを確認した。このことにより、健常芽胞と損傷芽胞とが区別ができ損傷芽胞の計数評価ができるようになった。この成果について、理論考証がやや遅れたものの、現在、研究代表者を中心として論文投稿を準備中である。
また、上記の損傷芽胞の計数法の確立により各種殺菌ストレスにおける損傷芽胞の計数評価と動態解析を行った。野生株を用いた基準法である固体平板培養法との比較においては、加熱殺菌では基準法と対象法との生菌数の差分が大きく、これが損傷菌の存在を示すものと考えられる。加熱殺菌では、芽胞膜や膜上に存在する発芽系酵素群などのタンパク質への損傷が起こる可能性があり、今後はこれらの欠損株を用いた損傷・回復機構の解明へと進めていく計画である。一方、γ線および深紫外線殺菌では差分が小さく、加熱殺菌と比較して損傷菌の存在が少ないことを確認した（朝田ら、VINANST-14、日本防菌防黴学会、2021）。γ線および深紫外線はDNA損傷を引き起こすため、今後はDNA損傷の検出や、各種DNA修復遺伝子群の影響を評価し、損傷・回復機構について検討を進める計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染症の影響により、研究推進に必要な研究設備（顕微鏡用カメラ）がメーカー生産に遅れが生じているため、導入できていない。一方、試験に供する遺伝子変異株のターゲット遺伝子の選定、欠損および/または蛍光タンパク質発現株の構築は計画通り推進中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の成果に引き続き、加熱殺菌、深紫外線殺菌を中心にさらにとした殺菌処理に対する損傷・回復機構の解明を推進する。加熱殺菌は、損傷菌が発生しやすく、この要因となる損傷部位と修復機能の検討を、発芽制御系（発芽レセプターの制御系）やＤＮＡ保護系（DNA結合タンパク質関与のsspA sspB）の各種遺伝子変異株を用いて行う。各種芽胞に対する損傷菌の定量比較と、発育遅延解析における発育速度や遅延時間などの増殖動態の解析から、影響度評価を進める計画である。一方、γ線および深紫外線殺菌は、増殖時間での損傷菌としての表現型が少ないが、DNA損傷（一本鎖切断、二本鎖切断、塩基損傷等）や各種修復遺伝子（非相同末端結合修復関与のykoVU、相同組み換え修復関与のrecAなど）の発現解析、遺伝子変異株の動態解析を比較することで、実態解明を行う計画である。さらに、これらの修復遺伝子の働きを詳細に解明するために、蛍光タンパク質の発現系を組み合わせ、シングルセル顕微画像解析による修復遺伝子の発現制御機構の詳細解明を進める計画である。具体的には、まず各種遺伝子変異株（破壊株）や、蛍光タンパク質発現株の構築を行い、これらの芽胞群を用いて各種殺菌処理に対する損傷菌定量比較、増殖動態の解析によって、各損傷・修復経路の影響度比較を行い、主要な反応経路を明らかにする。さらに、蛍光タンパク質発現系によって顕微鏡を用いたシングルセル応答解析に加え、マイクロプレートリーダーを用いた細胞集団の評価を行い、細胞集団全体と個々の亜集団の関連性について考察し、全容の解明を進める。
尚、本研究推進に必要な研究設備である顕微鏡用カメラは、新型コロナウイルス感染症対策とウクライナ情勢問題によるメーカーの生産影響の遅延を受け、取得が遅れる見込みである。そのため、機種の再選定を含め、速やかに導入を行える方策を講じる予定である。
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| Causes of Carryover |
本研究推進に必要な研究設備である顕微鏡用カメラは、新型コロナウイルス感染症対策と半導体不足のためメーカーの生産影響の遅延を受け、昨年度中の取得ができない状態であった。また、初年度に購入予定だったカメラでは感度が悪く、実験試料（細菌芽胞）が鮮明に撮影できない可能性があったため、今年度使用額と合わせて、より高感度なカメラを購入する予定である。
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