2022 Fiscal Year Research-status Report
殺菌ストレスで発生する損傷菌の動態解析と予測モデリングの構築
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21K05489
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
朝田 良子 大阪公立大学, 大学院工学研究科, 助教 (60546349)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古田 雅一 大阪公立大学, 大学院工学研究科, 教授 (40181458)
坂元 仁 大阪公立大学, 研究推進機構, 客員研究員 (40570560)
土戸 哲明 大阪公立大学, 研究推進機構, 客員教授 (50029295)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 食品科学 / 微生物制御 / DNA損傷 / 細菌芽胞 / 損傷菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、DNAの損傷と修復（非相同組換え末端結合修復関与のykoVUと相同組換え修復関与のrecA）および保護（DNA結合タンパク質SASP遺伝子のsspA sspB）機構の関連性や細胞損傷、回復機構の特性について、枯草菌の関連遺伝子破壊株を用い、平板法と液体培養法の比較による差分培養法（DiVSaL法）によって解析した。
その結果、細菌芽胞のγ線照射に対する感受性は、SASPによる保護作用と、NHEJによる修復作用が関与することが示唆された。一方、UV-C照射ではSOS応答に関連する△recA株に感受性化がみとめられた。特に△recA株では、照射線量に応じて細胞集団における比増殖速度の低下を確認した。Flowcytometryを用いた解析により、UV-C照射した△recA株では、一部の細胞集団が増殖異常を起こすことを確認した。このことから、recAは栄養増殖過程でDNA損傷修復への寄与が大きいことを確認した。recA遺伝子は、様々な修復遺伝子制御に寄与しており、現在、修復制御機構の詳細解析を推進中である。
一方、加熱処理では、増殖の遅延を伴う損傷が認められ、特に発芽過程への作用が大きいことを見出した。発芽損傷現象を詳細解析するため、発芽システムを構成するコルテックス分解酵素群（cwlJ sleB ydhD yaaH）や、発芽レセプターの遺伝子欠損株を構築し、解析を推進中である。あわせて、静菌性を示すことで知られる精油成分のthymolを加熱処理に併用すると、発芽過程に加え、発芽後成長の過程でも抑制する効果をみとめた。細菌芽胞の発芽成長過程は、主に3つのプロセス（発芽、発芽後成長、栄養増殖）からなることが知られており、損傷菌の予測、制御理論の構築には、各種処理が発芽成長過程のどこに影響を及ぼすのかを明らかにし、修復を抑制する理論を構築することが求められる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでE.coliなどの栄養細胞を対象として確立されていた損傷菌計数法（DiVSaL法）をBacillus subtilis芽胞に適用するための理論構築とその実証データを揃えるのために想定以上の時間がかかった。しかし、DiVSaL法の芽胞への適用性について公表（論文化）できたことで、Bacillus subtilis芽胞にその他の殺菌法での処理も行い、評価法を確立、統一して実験を進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの加熱、放射線処理に引き続き、薬剤（過酸化水素、過酢酸等）の処理における損傷菌の動態解析を行う。また、昨年度までの加熱、放射線処理した芽胞では1次損傷（芽胞膜）だけでなく、2次的に産生した活性酸素種（酸化ストレス）による損傷および芽胞膜に局在する発芽システムの損傷が生じる。酸化ストレス損傷については、各種抗酸化系（catalase、SOD）、発芽系の損傷についてはそのレセプターとコルテックス分解酵素の遺伝子群（gerA, gerB, gerK）、またそれらの挙動解析用に各種蛍光タンパク質センサー群を用いて損傷修復過程の時間的、空間的な細胞損傷・発育遅延挙動を明らかにする。これらは、本プロジェクトで取得した蛍光顕微鏡による解析システムを用いて行う。
さらに、本研究成果を活用し、Flowcytometryまたは蛍光顕微鏡システムによる発芽過程の動態解析を行うことによって、各種処理における発芽成長モデルの各プロセスへの係数の影響を明確化し、損傷菌発生率の予測モデルの構築を目指す。
また、それぞれの殺菌条件に対する損傷菌の予測モデルに対し、より実効性をもったモデル式の実現を図るため、各種処理に対する発芽成長過程にとって基本的な栄養素、温度、pH等の変動の影響を評価し、数式化を試みる。昨年度の成果から本研究において、これまで解析した処理方法による発芽、成長過程の損傷・修復機構の影響の違いを体系的に確認するとともに、併用作用等による効果も検討する。
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| Causes of Carryover |
一般微生物の生菌数測定のための発育遅延解析法基盤とする二重後培養法の１つであるDiVSaL法の芽胞への適用性についてその理論基盤を提出した。この論文発表までの理論構築とその実証データを揃えるのに想定以上の時間がかかった。そのため、次のステップの各種殺菌ストレスによる損傷修復データでの論文投稿が次年度に持ち越して遅れてしまい、その分の英語校正および論文投稿代等を次年度に移行した。今年度はUVC照射、加熱処理、DiVSaS法理論の論文投稿準備を進めている。
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