2022 Fiscal Year Research-status Report
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21K05494
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
高畠 令王奈 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 上級研究員 (20463466)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 極低濃度 / PCR / 標準物質 / 定量分析 / 1分子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
一般的に、PCRは、僅か１分子のDNAをも検出可能であると考えられてるが、そのような検証は未だなされていない。本研究では、PCRの標的配列を１個単位で制御可能な標準物質を作製、利用し、DNA1分子に対する検出性能の評価を目的としている。1コピーの検出性能を正確に評価するには、確実に標的配列を１コピー含む標準物質の存在が不可欠である。本研究では、当初、このような標準物質として細胞を用いる手法を検討していたが、標準細胞をインクジェットで分注する技術の利用が困難になってしまったため、別のアプローチを試みることとした。具体的には、高濃度のDNAを限界まで希釈する限界希釈法を利用することにした。手法としては、1コピーの標的配列と、それとは別の確認配列を同じDNA分子内に複数コピー導入し、標準DNAとする。このような標準DNAの溶液を限界まで希釈すると、DNAを含む溶液と含まない溶液に分かれ、DNAを含む溶液には、非常に高い確率で1分子のDNAが含まれるものと予想される。1コピーの標的配列が存在している希釈画分を得るために、各分注溶液について、確認配列を標的にPCRを行い、標準DNAの存在を確認する。これにより、細胞法と同等の検証が可能となる。今年度は、このような標準DNAのコンストラクションを行った。文献より、リアルタイムPCRでは、4コピー程度以上のDNAであれば検出可能である旨の報告があることから、確認配列を8コピー導入した標準DNAを作出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、DNA1分子の検出性能の評価を実施するために、そのもととなる標準DNAのコンストラクションを行った。標準DNA作製にあたり、もっとも困難が予想されたのは、同一DNA分子内に、PCR標的配列以外に複数の確認配列を導入することである。一般的には、同じ配列を繰り返し導入すると、分子内で立体障害等が発生することが危惧された。また、コンストラクション作製の際にも、オーバーラップPCR等による簡易なクローニング法が利用できず、困難が予想された。本研究では、当初は、細胞に複数の確認配列を導入する予定であり、そのための遺伝子コンストラクションについては、In fusion等の最新のクローニング技術を駆使し、一通り完成していた。そのため、細胞法用に作製したDNAを限界希釈法用の標準DNAに転用することにした。PCRの標的配列としては様々なものが想定されることから、確認配列については、既存の生物の遺伝子とは相同性を持たないユニークな配列を使用することが望ましいと考えられた。そこで、確認配列には、産業技術総合研究所において開発された人工配列CRM6203を基本とした600 bpからなる配列を採用した。事前の検証実験により、CRM6203については、4コピー以上存在すれば、ほぼ100%検出可能であることを確認済みである。本配列を、立体障害等を緩和させるために、2 kb以上のスペーサー配列を間に挟んで、8コピーとなるように同一プラスミドDNA内に導入し、標準DNAとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、これまでに作製した標準DNAを限界希釈し、標的配列を1コピー含むように調製した標準物質を用いて、PCRによるDNA1分子検出能を評価する予定である。標準DNAは、コンストラクションの作製および取り扱いやすさを考慮し、環状のプラスミドDNAの状態として調製・保存している。限界希釈を行う際には、上記プラスミドDNAを制限酵素等で切断し、線状構造（リニア―）にしてから使用することが望ましいと考えられる。さらに、ごく低コピー数のDNAは、プラスチックチューブやチップ類等への吸着の影響を受けやすいことから、限界希釈を行う際には、標準DNAを保護するために、キャリアDNAを含む溶液で希釈する必要がある。このようなキャリアDNAは、PCR標的配列や確認配列と相同性をもたず、さらに、DNA分解酵素等のコンタミネーションがないことも確認された、一定の品質をクリアした核酸を使用することが望ましいと考えられる。そのための候補核酸について、情報収集を行う。標準DNAを線状化した後、吸光度等で濃度を測定し、キャリアDNAを含む溶液で限界希釈を行う。さらに、確認配列を利用して標準DNAを1コピー含む画分を確認・回収する。このように調製された、標的配列を1コピー含むことが確認された標準試料について、DNA1分子の検出性能を評価する。また、このような評価を行う際には、1分子にまで限界希釈されたDNAの安定性等についても、同時に検討する必要があると考えられる。
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| Causes of Carryover |
本研究では、当初、標的配列を１コピー含む標準物質について、細胞を利用することを想定していたが、利用が困難になってしまったため、限界希釈法を採用することとした。そのため、今年度は、限界希釈法に使用する標準DNAを構築することに注力した。次年度は、リアルタイムPCRによる１分子検出能の評価を行うことから、PCRに用いる試薬類等を大量に購入する必要がある。
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