2021 Fiscal Year Research-status Report
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21K05497
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
堀籠 智洋 東北大学, 農学研究科, 助教 (10771206)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | リボソームRNA遺伝子 / rDNA / 核膜 / 老化 / 若返り |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題1 核膜結合がrDNA安定化および細胞老化抑制に果たす役割の解明： 我々の先行研究により、非rDNA領域であるMAT座でのDNA二本鎖切断が核膜と結合できなくなると、切断誘導性の姉妹染色分体間接着（コヒージョン）の形成に異常が生じることが明らかとなっている。われわれは2021年度に、リボソームRNA遺伝子（rDNA）でDNA二本鎖切断を誘導した時のコヒージョン形成について、顕微鏡を用いた解析により検証した。解析では、rDNA反復配列の1箇所にI-SceI切断部位とtetO配列を導入した株を用い、ガラクトースによりI-SceIエンドヌクレアーゼを発現誘導し、その切断部位をTetI-mRFPにより可視化する株を用いた。通常、DNA複製後のDNA二本鎖切断部位は、コヒージョンにより1つの赤色蛍光輝点として観察されるが、コヒージョンに欠陥がある細胞では2点として観察される。切断誘導後のrDNAが核膜に局在できない変異株において、切断誘導性のコヒージョンに欠陥が見られることを明らかにした。
課題2 老化細胞における核膜でのゲノム安定化についての解析： 本研究では、MAT遺伝子座にDNA二本鎖切断を誘導できる株を用いて、野生株の老化細胞における核膜とDNA二本鎖切断部位の結合を定量的顕微鏡法により解析する。細胞をビオチン標識した後分裂を繰り返させて細胞を老化させ、ストレプトアビジン磁性ビーズにより老化細胞を選別した。老化細胞においてDNA二本鎖切断の誘導効率が低下することが明らかとなり、その原因が切断をする酵素エンドヌクレアーゼの転写レベルの低下によるものなのか、それとも切断部位のヘテロクロマチン化などに由来するものなのかについて検証を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新型コロナウイルス感染症のまん延が続いており研究活動が一部制限されている状況が続いている。そのような中でも以下の成果を得ており、研究はおおむね順調に進展している。
課題1については予定していた目的の主要な部分を達成して論文としてまとめている段階であり、予定よりも早い進捗である。
課題2についてもおおむね順調に進展している。細胞をビオチン標識して老化細胞を選別する方法を用いて老化細胞を選別することに成功し、DNA二本鎖切断を誘導した。老化細胞で切断誘導効率が低いという思いがけない困難も出たが、比較的若い老化細胞を集めることでその問題も解決しつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題1： rDNAが不安定になる様々な変異とnup120破壊との二重変異株を作製し、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でrDNAの安定性に関する遺伝学的解析を行う。
課題2： 老化細胞におけるDNA二本鎖切断の核膜移行をZoning法と呼ばれる定量的顕微鏡法により解析する。また老化細胞で切断誘導効率が低い原因について、エンドヌクレアーゼの転写などに注目して解析する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由： 新型コロナウイルス感染症のまん延により、今年度はチップを用いた老化細胞解析が予定よりも少なかった。そのため物品費の使用が少なくなった。また全ての学会がオンライン開催となったため旅費の必要がなくなった。
使用計画： 次年度からマイクロ流路やビオチン、ストレプトアビジン磁性ビーズなどを用いた解析が本格化する。そのための物品費が必要となる。
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