2023 Fiscal Year Research-status Report
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21K05497
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
堀籠 智洋 東北大学, 農学研究科, 准教授 (10771206)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | リボソームRNA遺伝子 / rDNA / 核膜 / 老化 / 若返り |
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題1 核膜結合がrDNA安定化および細胞老化抑制に果たす役割の解明： リボソームRNA遺伝子（rDNA）においてDNA二本鎖切断を誘導した時のコヒージョン形成と核膜の関係について、顕微鏡を用いて定量解析した。rDNA反復配列の1箇所にI-SceI切断部位とtetO配列を導入した株を用い、ガラクトースによりI-SceIエンドヌクレアーゼを発現誘導し、その切断部位をTetI-mRFPにより可視化する株を用いた解析を行った。その結果、rDNAの核膜孔結合に欠陥のあるnup120破壊株及びtel1破壊株におけるDNA損傷誘導性コヒージョンが、野生株と比較して違いがないことが示された。これにより核膜孔はrDNAの安定性に寄与しているが、これはDNA損傷誘導性コヒージョンを介した反応ではないことが示された。
核膜結合によるrDNA安定化の作用点を遺伝学的に同定するため、fob1 nup120二重破壊株を構築した。パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でrDNAの安定性に関する解析を行ったところ、Fob1依存的なrDNA損傷の修復に核膜孔が関与しないことが明らかになった。
課題2 老化細胞における核膜でのゲノム安定化についての解析： rDNAの反復配列中にADE2遺伝子をひとつ導入した酵母細胞を、ビオチン標識した後に分裂を繰り返させて細胞を老化させ、ストレプトアビジン磁性ビーズにより老化細胞（平均5～6回出芽）を選別した。老化細胞およびそこから生まれた若い細胞を寒天固形培地に播種して、ハーフセクターと呼ばれる赤白半円ずつのコロニーが形成される確率を求めることで、ADE2遺伝子の抜け落ちの頻度、つまりrDNAの不安定性を定量的に測定した。老化細胞ではそこから生まれた若い細胞よりも高い頻度でのADE2遺伝子の抜け落ちが観察され、rDNAが不安定になっていることが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究はおおむね順調に進展しており、以下のような成果をあげている。
課題1については予定していた目的の主要な部分を達成して論文原稿としてまとめた。現在、査読を受けて指摘された項目について追加実験を行っている。
課題2についてもおおむね順調に進展している。特にADE2の脱落を指標とした老化細胞とその娘細胞におけるrDNA安定性の解析は、rDNAの不均等分配を示したGanleyらの論文におけるパルスフィールドゲル電気泳動とは別の方法で母娘細胞の不均等性を確認した初めての結果である（Ganley et al., Mol Cell 35:683-93 (2009)）。細胞分裂における老化と若返りの不均等性を理解するうえで非常に重要な結果であり、想定以上の進展と言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題1： Fob1に依存せずにrDNAが不安定になるsgs1破壊と、nup120破壊との二重変異株を作製し、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でrDNAの安定性に関する遺伝学的解析を行う。
課題2： 老化細胞とその娘細胞におけるrDNAの安定性をADE2の脱落により定量解析する。野生株に加えて、sir2破壊株、fob1破壊株、nup120破壊株で解析する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由： 老化細胞の取得を、マイクロ流路からビオチン、ストレプトアビジン磁性ビーズを用いた方法に切り替えたが、その方法の確立と実施に想定以上に時間を要した。そのため補助事業期間を延長する必要が生じたため次年度使用額が生じた。
使用計画：ビオチン（sulfo-NHS-LC-biotin）およびストレプトアビジン磁性ビーズを購入し、老化細胞を用いた解析を行う。解析のため、顕微鏡観察用の試薬も購入する。研究成果は学会での発表、および論文投稿により公開する。
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