植物における精密ゲノム編集技術ジーンターゲッティングの効率化

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05535
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 横井 彩子 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (10760019)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ジーンターゲッティング / ゲノム編集 / イネ / テロメア / DNA修復機構

Outline of Annual Research Achievements

ゲノム編集技術の一つであるジーンターゲッティング（GT）は、DNA修復経路の一つである相同組換えを介して標的遺伝子を望み通りに改変できるため、植物の基礎研究や作物育種の加速化に非常に重要な技術である。代表者はこれまで、広範な作物種に適用できる汎用的GT系を確立するためにGT効率の簡便な評価システムを構築し、GT効率を向上させる化合物処理や鋳型配列のデリバリー系の開発を行ってきた。その中で、Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 阻害剤処理や分割型Transferred DNA (T-DNA) でGTの鋳型配列をデリバリーすることによってGT効率を向上できることを明らかにしてきた。そこで本課題では、これら2つのアプローチによりGT効率が向上する現象のメカニズムを解明し、その知見からGT実験系のファインチューニングを行い、更なる高効率化とより実効性のある実験系の確立を目指す。
令和3年度は、PARP阻害剤処理と分割型T-DNAの利用によるGT効率向上のメカニズム解明のため、CRISPR/Cas9システムによりイネPARPホモログの単独および複数のノックアウト系統の作出と一体型あるいは分割型T-DNAを用いたGT実験によりGT系統の作出を行った。また、本研究ではGT系の更なる効率化を目指し、ペアのテロメア配列を持たせたベクター（テロメアベクター）によりGT鋳型配列をデリバリーさせるGT系の開発も試みる計画である。令和3年度はテロメアベクターを利用したレポーターコンストラクトの構築に取り組んだ。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

イネのPARPタンパクは、4つの遺伝子がホモログとしてゲノムにコードされており、各タンパクの機能分化については不明な部分が多い。これまでに、PARP阻害剤をイネカルスに処理することでGT効率が向上することを明らかにしてきたが、GTのさらなる効率化にはどのPARPホモログの活性を阻害すべきか、また、PARPが関わるどの代謝経路を抑制すべきかを明確にすることが重要であると考えた。そこで令和3年度は、CRISPR/Cas9システムによりイネPARPホモログの単独および複数のノックアウト系統の作出を行った。各ホモログ遺伝子について、2種類のガイドRNAを設計し、それぞれの発現カセットをSpCas9と共に発現させるバイナリーベクターを構築した。そのバイナリーベクターをアグロバクテリウムを介してイネカルスに形質転換し、変異が導入された個体を栽培している。各ホモログ遺伝子について2種類設計したガイドRNAの内、変異効率が高かったものを1つのバイナリーベクターにSpCas9発現カセットと共に配置し、全ホモログ遺伝子をノックアウトするためのベクターの作出も行った。これらのPARP変異体イネにおいて相同組換え効率をレポーター遺伝子の発現で簡便に評価できる実験系の構築も行った。また、分割型T-DNAの利用によるGT効率向上のメカニズム解明のため、一体型あるいは分割型T-DNAによりGT鋳型をデリバリーするGT実験を行い、GTカルス系統から再分化個体を得た。
より実効性のあるGT系の確立のためには、細胞内に高コピーのT-DNAをデリバーしつつも、それらをゲノムに挿入させない工夫が重要となる。そこで令和3年度は、ペアのテロメア配列をT-DNAの末端に付加したテロメアベクターに選抜マーカー遺伝子およびレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子を配置したテロメアベクターの構築に取り組んだ。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度に作出したPARPホモログのノックアウトイネ系統からヌル変異体を取得し、それらにおいてレポーターの発現によりT-DNA挿入頻度をモニターできる実験系によってT-DNA挿入効率を評価する。また、PARPホモログを全てノックアウトしたイネも作出する予定である。さらに、レポーター遺伝子の発現により相同組換え効率を簡便に評価できるレポーターコンストラクトを形質転換したイネ系統も作出しており、それらにおいてPARPホモログをノックアウトすることで相同組換え効率に影響を及ぼすかどうかを検討する。一方、GT効率向上にはDNA修復経路の一つである非相同末端結合経路の阻害が効果的であることが考えられるため、他のDNA修復経路の阻害剤処理により相同組換え効率が向上するかどうかも上記レポーターコンストラクトを用いて評価する。
分割型T-DNAの利用によるGT効率向上のメカニズム解明のため、一体型あるいは分割型T-DNAによりGT鋳型をデリバリーするGT実験によって得たGT系統の次世代においてサザンブロット解析およびデジタルPCR解析を行い、分割型T-DNAの利用によりGT鋳型配列がゲノムに多コピー挿入されているかどうかを解析する。
植物細胞に導入したT-DNAをゲノムに挿入させない技術を確立するため、テロメアベクターを利用したレポーターコンストラクトを作製し、まずは染色体外で維持されるかどうかを検証する。その後、テロメアベクターを利用してGTの鋳型配列をデリバリーするGT系を構築することを試みる。

Causes of Carryover

コロナ禍における消耗品の未納などにより、調達ができなかった物品があったことなどから未使用分の予算が生じた。R4年度の予算と合わせて、消耗品等の購入に計画的に使用する予定である。