2022 Fiscal Year Research-status Report
Design of biopesticide using target cell recognition mechanism of dietary toxic protein with multiple target species
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21K05603
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
武部 聡 近畿大学, 生物理工学部, 教授 (20227052)
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2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 膜孔形成毒素 / 広域選択毒性 / Bacillus thuringiensis / 生物農薬 / スクミリンゴガイ / チャコウラナメクジ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はCryタンパク質の優れた標的細胞認識機構を用いた有害生物駆除法の確立を目指している。Cry46Abは土壌細菌Bacillus thuringiensis (Bt)が産生するβ型膜孔形成タンパク質毒素（βPFT）のひとつで、ボウフラのほか、スクミリンゴガイやチャコウラナメクジに食毒性を示すが、魚類やセンチュウには作用しないという生物種を跨ぐ選択毒性を示す。このCry46Abの標的生物認識機構を利用して、有害生物の効率的駆除および安全かつ環境負荷の小さい生物農薬の設計を行う。まず、Cry46Abの標的細胞認識に必要なペプチド領域を同定する。次に、このペプチドと他の毒素とを組み合わせて使用することで有害生物駆除の有効性を検討する。さらに、毒素に結晶化因子を付けて不溶化し、水中や多湿環境でも使用できる生物農薬の開発を試みる。
2021年度は、Cry46Abのアミノ酸配列と予想される立体構造から、標的細胞認識に必要なペプチド領域を絞り込んだ。2022年度は、このペプチド領域のアミノ酸置換変異体を多数作製し、ボウフラに対する殺虫活性を指標に受容体との結合に関与するアミノ酸を特定した。つぎに、このタンパク質の生物種を跨ぐ選択毒性について、スクミリンゴガイやチャコウラナメクジを用いた生物検定により確認した。今後、標的生物認識は受容体との結合で決まるのか、それに続く膜孔形成へのステップをも含むものなのかの検討を、標的生物の消化管から調製した冊子縁膜小胞を用い、殺虫活性が変化したアミノ酸置換変異タンパク質の結合性や標的細胞認識に必要なペプチド領域のエピトープ解析を行うことで進めていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度に絞り込んだCry46Abの標的細胞認識に必要なペプチド領域から、受容体との結合に関与するアミノ酸を特定した。Cry46Abの標的生物認識部位は、他の膜孔形成毒素との構造比較からドメインⅠに存在すると予想された。そこで、Cry46AbのドメインⅠを構成するアミノ酸配列から受容体との結合に携わる領域の候補を数カ所選び、それぞれの領域のアミノ酸をアラニンに換えたアミノ酸置換変異体を作製した。これら変異タンパク質を調製し、ヒトスジシマカ幼虫を用いて生物検定を検討したところ、殺虫活性が変化した変異体を幾つか得ることができた。Cry46Abはボウフラ以外に淡水生巻貝やナメクジにも食毒性を示す、広域選択毒性が特徴なので、変異体の他の生物種に対する殺活性も変化しているかを検討している。また、作成した変異Cry46Abの変異導入部位は受容体結合に関わる領域なので、ボウフラの冊子縁膜小胞（BBMV）を調製して変異タンパク質の消化管細胞への結合の検出を進めている。
スクミリンゴガイやチャコウラナメクジは外来種で市販されていないので、生物検定等の実験に用いる個体は研究室で飼育する必要がある。両方とも、常時数十匹の親貝を飼育し、年間を通じて採卵、孵化させ、生物検定に必要な数の稚貝が得られる環境を整えた。また、チャコウラナメクジの生物検定法を確立した（例えば、チャコウラナメクジは水や汚れた空気に弱く、濡れたエサは食べないので、検定中も換気に注意し、Cry46Ab懸濁液を飼料に混ぜて乾いた状態で提供する必要がある）。
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| Strategy for Future Research Activity |
Cry46Abの標的細胞認識部位と推測される領域のアミノ酸を置換した変異タンパク質のヒトスジシマカ幼生を用いた生物検定により、受容体との結合に関わるアミノ酸の候補を見つけることができたので、今後は変異タンパク質の消化管細胞への結合の検出、細胞膜上の小孔形成の確認を行い、さらにCry46Abの認識機構を用いた生物農薬の設計に取りかかる。また、スクミリンゴガイやチャコウラナメクジに対する変異タンパク質の食毒性も同様に調べ、Cry46Abの広域選択毒性機構についても検討する。
変異タンパク質の消化管細胞への結合は、抗Cry46Ab抗体や標的生物消化管から調製した上皮細胞冊子縁膜小胞（BBMV）を用いて検討する。細胞膜上の小孔形成の確認は、標的細胞膜にある受容体への結合能を保持する変異体については、食毒試験後のLDH漏出試験や人工リン脂質二重層膜を用いたカリウムイオン漏出試験で膜孔形成の有無を調べる。以上の実験を複数の標的生物種について行い、Cry46Abの標的生物認識が受容体との結合で決まるのか、それに続く膜孔形成へのステップをも含むものなのかを明らかにする。
Cry46Abの認識機構を用いた生物農薬の設計に向けて、標的細胞認識部位のみのペプチドで受容体結合能を有するのかをエピトープ解析等を用いて調べる。ι(イオタ)毒素との融合タンパク質の調製は、Btの胞子形成期に高い転写活性を示す2つのプロモーター配列とタンパク質結晶化因子を組み込んだ発現ベクターpPcyt1A-4AaCterに、Cry46Abの標的細胞認識部位と強い活性を持つ毒素の膜孔形成成分をつないだDNA断片を連結したプラスミドを作製し、Btの発現系を用いて調製する予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度経費のうち、旅費が使用できなかった。新型コロナウイルス感染対策による移動制限は解除されてきたが、国内外で催される学会では現地開催はまだ少なく、virtual formatが主流なので、旅費を使うことができなかった。
また、生じた次年度使用額は昨年度からの繰越額とほぼ同じで、本年度は当初予定通りの経費を使用している。
次年度の旅費は学会発表だけでなく、調査・情報収集への使用も計画する。また、他の項目は当初予定通りの執行と研究の進捗に合わせた予算の使用を行い、全額の執行を目指す。
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