2021 Fiscal Year Research-status Report
昆虫腸管の囲食膜タンパク質はインシュリンシグナルを介してボディサイズを規定する
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21K05615
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
川畑 俊一郎 九州大学, 理学研究院, 教授 (90183037)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 囲食膜 / キチン結合タンパク質 / Peritrophin-15b / GAL4/UASシステム / インスリン様ペプチド / 腸内細菌叢 / 黄色ショウジョウバエ / インスリンシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昆虫の腸管には囲食膜 (peritrophic matrix) が存在し、哺乳類のムチン層に相当する物理的な腸管上皮の防御壁である。体内に侵入した微生物から腸管上皮を守る保護層として機能しており、キチンとキチン結合タンパク質から形成されている。本研究では、黄色ショウジョウバエ（ハエ）を用いて、囲食膜構成タンパク質であり、キチン結合タンパク質の１種であるPeritrophin-15b (Pin-15b) に着目し、Pin-15bの組換え体やPin-15b RNAiハエを用いてその機能解析を行った。
まず、GAL4/UASシステムによりPin-15b RNAiハエを作製し各種解析を行った。成虫の中胸の長さを測定したところ、ノックダウン系統ではコントロール系統と比較して有意に増加することが明らかとなった。そこで、血リンパ中の糖濃度を測定したところ有意な差は確認できなかった。一方、インスリン様ペプチドであるInsulin-like peptide 2 (ILP2) の転写量を測定した結果、ノックダウン系統において転写量が増加した。したがって、ノックダウンによるILP2転写量の増加が、インスリンシグナル経路の活性化を介して体長の増加を誘引したと考えられた。また、ノックダウン系統においては飢餓耐性が上昇することが明らかとなった。
さらに、腸内細菌叢について調べたところ、ノックダウン系統ではLactobacillus属とProvidencia属の細菌数が増加していた。また、インビトロの結合実験により、Pin-15b組換えタンパク質は菌種により異なる相互作用を示した。おそらくPin-15bは腸内細菌叢の恒常性維持の働きを担っていると考えられる。以上の結果から、Pin-15bは代謝経路や血リンパ中の糖濃度、腸内細菌叢に影響を与えることで、体重や体長の増加とう表現型が現れることが示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は当初以下の実験を遂行して、前述の「実績概要」に述べた結果を得た。当初の計画に対して、計画の８０％程度をカバーする実験を行くことができ、今年度の実験計画は順調に進展している。
1）野生型ハエ (w118) を用いて、Pin-15b 遺伝子の発現組織を調べた後、病原性細菌の経口感染による Pin-15b 遺伝子の発現誘導を、野生型ハエ (w118) やコントロールハエ (Gal4>+) を用いて調べた。2）Pin-15b 遺伝子のノックダウン系を用いて生存率を含む表現型解析を行った。その際、蛍光染色したデキストランを用いて囲食膜の透過性に及ぼす影響も調べた。3）Pin-15b-ノックダウンハエの腸管での抗菌ペプチド (DiptericinとCecropin) 発現をコントロールハエと比較した。また、病原性細菌の野生株とプロテアーゼや毒素欠損株を用いて、経口感染の影響をノックダウンハエとコントロールハエの生存率で比較する。4）Pin-15b-ノックダウンハエのボディサイズに及ぼす影響を通常の餌培地や低栄養培地の条件下で幼虫と成虫で調べた。ボディサイズは、身長と体重を測定するが、その際、総タンパク量と脂質量 (Triglycerides) の変化量を測定するとともに、体液中の糖（グルコースとトレハロース）を定量した。5）餌に色素を添加しておき、摂食量の変化を分光学的に調べて、ノックダウンが単に食事量の増加に依存するかどうかを、野生型ハエやコントロールハエと比較した。6）Pin15b-ノックダウンによる体液中のインシュリン様ペプチド (Ilp2) や哺乳類のグルカゴンに相当するアディボキネティクホルモン (AKH) の濃度の変化を定量した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策は、以下の実験計画にしたがって研究を推進したい。令和4年度は、腸管の感染防御に関わる Pin-15b の役割を解明するとともに、Pin-15b によるインシュリンシグナルを介したボディサイズを規定する分子機構を浮き彫りにしたい。
1）インシュリン感受性ニューロンや両ホルモン受容体と Pin-15b 遺伝子のダブルノックダウンなどを行って、Pin-15b のインシュリンシグナルへの関連を詳細に調べる。2）ボディサイズの変化に対して腸管の常在細菌の影響も推定されることから、無菌ハエを用いたノックダウン実験や、無菌ハエにハエ腸管から単離した常在菌の戻し実験等を行う。3）組換えタンパク質 (rPin-15b) を用いて、ポリクローナル抗体を調製する。4）トランスグルタミナーゼ （TGase）は Pin-15b を架橋反応により繊維化し、囲食膜を安定化すると推定しているが、rPin-15b の野生型タンパク質へのアミン基質 (ダンシルカダベリンやビオチン化ペンチルアミンなど) のTGase 依存的な取り込み反応や、架橋反応による rPin-15b の多量体化とプロテアーゼ耐性をウェスタンブロットで解析する。5）rPin-15bを用いて、ハエ培養細胞由来のタンパク質に対して免疫沈降やビオチン化を応用した BioID 法などを用いて回収し、Pin-15b と相互作用するタンパク質を質量分析により同定する。6）同定されたタンパク質に対して、ノックダウンやハエ培養細胞を用いて Pin-15b 遺伝子や TGase 遺伝子の共発現系を用いて解析し、それらの機能を解明する。
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Research Products
(1 results)
