2022 Fiscal Year Research-status Report
Construction of artificial chromosomes using silkworm chromosomes with holocentric kinetochores
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21K05617
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
門 宏明 九州大学, 農学研究院, 准教授 (30616412)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 分散型動原体 / カイコ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本申請では、カイコ染色体の特徴（分散型動原体、反復配列とレトロトランスポゾンによるテロメア）を利用し、効率よく細胞内で維持可能な人工染色体の構築を目的としている。細胞外から導入されたDNAが、細胞内に長期間維持されるには、効率の良いDNA複製と分配が必要である。そのためには、DNA複製起点、セントロメアと動原体タンパク質複合体、テロメアが必要なエレメントである。① DNA複製起点を含むDNA断片の単離、② 動原体タンパク質をBac DNA上に局在化させることによるDNA分配効率の向上を試みている。
昨年度に引き続き本年度も、DNA上に動原体タンパク質複合体を局在化させる技術開発、および、カイコ細胞内で効率よく複製する複製起点を含むDNA断片の単離のための技術基盤の整備を行った。
まず、カイコ細胞内でDNAを長期間維持させるのに必要なエレメントをもつ長鎖環状DNAを、効率よくin vitroで構築するために、Golden gate法を用いることにした。この方法では、~ 10 kbp程度のエレメントをそれぞれプラスミドを作製しておき、様々な組み合わせで酵素反応させることにより、簡便に効率よく様々な種類の長鎖環状DNAを作製可能になる。そのためのベクター系のシステムを作成し、~ 100 kbp程度の長鎖DNAが構築可能になった。
また、動原体タンパク質を長期間、細胞内で発現させると発現量の低下がみられたため、ヒトFKBP12、および、大腸菌dihydrofolate reductase (ecDHFR)タグを使用して、可逆的に細胞内のタンパク質量を制御可能なシステムも構築した。動原体タンパク質をDNA上に局在化するために、dCas9を使用して目的タンパク質を染色体上に局在化することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請時に予定していた実験系の構築において、いくつか変更が生じたが、それに対応する実験系の構築により対処できた。特に、長鎖環状DNAは、ベクター側の改変を行うためには、その都度大腸菌内で遺伝子組み換えにより編集を行う必要があるが、Golden gate法により数断片をin vitroで組み上げるシステムを構築したので、来年度から行う複数のコンストラクトを簡便に構築できるようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度は、引き続きベクターの改良を行いつつ、細胞内でDNAを長期間維持させるのに必要なエレメント（DNA, 動原体タンパク質）の同定を試みる。
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Research Products
(1 results)
