2022 Fiscal Year Research-status Report

共生器官特異的ペプチドを標的としたRNAiによるアブラムシの共生戦略の解明

Research Project

Project/Area Number	21K05619
Research Institution	Kagoshima University
Principal Investigator	内海俊樹鹿児島大学, 理工学域理学系, 教授 (20193881)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	アブラムシ / ブフネラ / 共生 / 菌細胞 / システインリッチペプチド / RNA干渉
Outline of Annual Research Achievements	アブラムシは、体内の菌細胞とよばれる共生器官で、共生細菌ブフネラとの絶対共生を成立させており、そこには機能不明の菌細胞特異的システインリッチペプチド（BCR）が存在する。本研究は、RNAiによるBCR遺伝子の発現抑制を試み、「アブラムシのBCRはブフネラとの共生に必須であるか？」という問いに答えることを目的とする。エンドウヒゲナガアブラムシApL系統を研究材料とし、それぞれのBCR遺伝子を標的とする合成RNAを人工飼料に添加して給餌し、BCR遺伝子の発現、給餌後の生存率と繁殖率を検討した。これまでの研究で、アブラムシ体内のRNaseの活性により、給餌したRNAが分解され、発現抑制の効果にばらつきがあることが考えられた。そこで、令和3年度は、RNaseに耐性があるとされる修飾RNA（LNA, Linked Nucleic Acid）を合成して使用した。しかし、いずれのBCR遺伝子を標的としたLNAを給餌しても、標的遺伝子の発現抑制や生存率の低下は観察できなかった。このことから、LNAによるRNAiの効果は期待できないと判断した。一方、アブラムシ１個体ごとの標的遺伝子の発現については、プロトコルの再検討などにより、解析の精度をあげることができた。令和４年度は、ApL系統の7種の全てのBCR遺伝子(BCR1-6, BCR8)について、令和3年度に確立した実験系と評価方法で検討した。これまで未検討であったBCR5, 6, 8のいずれのBCR遺伝子についても、合成RNAの給餌により標的遺伝子の発現が抑制され、生存率も有意に低下することが判明した。また、抗菌活性の弱かったBCR2, 4についても、混合給餌によって両遺伝子の発現を同時に抑制すると、生存率が低下することが判明した。これらのことから、全てのBCRが、アブラムシとブフネラとの共生に必須であろうと考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和３年度の研究により、LNAではRNAiの効果は見られないことが明らかとなり、令和４年度以降は、未修飾の合成RNAによる実験を実施することとした。プロトコルの再検討などにより、アブラムシ１個体ごとの標的遺伝子の発現の解析が可能となり、実験の精度をあげることができた。生存率と繁殖力については、再検討が必要な実験区もあるが、令和5年度中に必要なデータを揃えて研究をまとめたい。
Strategy for Future Research Activity	基本的な推進方策に変更はない。当初予定していたBCR6の組換えペプチドの生産と抗菌活性の検討には着手していないが、BCR6遺伝子の発現抑制は、生存率を低下させることが明らかとなり、共生に必須であると考えられる。令和５年度は、論文作成に必要な信頼性の高いデータの取得と整備を目指し、「アブラムシのBCRはブフネラとの共生に必須である」ことを示す初めての論文として出版することを最優先に研究を進めたい。
Causes of Carryover	学会発表と研究打ち合わせのための旅費を留保していたが、コロナ禍の状況を鑑みて、学会参加、及び、打合わせの実施を見送った。また、人工飼料調製用の試薬購入のために留保していたが、本年度の実験遂行分は賄うことができる見通しがついたため、次年度に購入して調製することとした。令和５年度は、関係学会は対面での開催の見通しが立っているため、旅費として使用する。また、人工飼料調製用の試薬購入、英文校閲などに使用する予定である。