2021 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of vitellogenesis in fish using genome genome editing technology
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21K05764
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
東藤 孝 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (60303111)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平松 尚志 北海道大学, 水産科学研究院, 准教授 (10443920)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / メダカ / 卵形成 / 卵黄形成 / 脂質 / タンパク質 / 卵成長 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、魚類の卵母細胞における広義の卵黄物質、すなわち中性脂質（油球）と卵黄タンパク質（卵黄球）の蓄積機構について、それらに関わる重要な分子群の機能を最先端のゲノム編集技術を用いることにより解析し、明らかにすることを目的としている。メダカを研究モデルとし、「課題1：油球形成機構の解析」と「課題2：卵黄球形成機構の解析」の2課題を設定して研究を進めている。
課題1：先ず、油球を構成する中性脂質の主要な供給源である超低密度リポタンパク質の代謝酵素（リポタンパクリパーゼ：Lpl）に着目し、メダカ卵濾胞組織におけるlpl遺伝子の発現を解析した。その結果、2種類のlpl遺伝子（lpl1とlpl2）のうち、lpl1のみが発現していることが示されたことから、lpl1の遺伝子欠損（KO）メダカを作出することとした。CRISPR/Cas9システムによる効率的な変異導入を達成するため、lpl１遺伝子に対する複数のガイドRNA（gRNA）候補を設計して検討した結果、フレームシフトを伴う変異導入に有効なgRNAの組み合わせが見出された。
課題2：卵黄タンパク前駆物質（ビテロジェニン：Vtg）の卵内への取り込みに必要な3種のリポタンパク質受容体（Lr7、Lr8、Lrp13）のそれぞれについて、メダカ卵濾胞での発現解析ならびに、KO魚の作出とそれらの表現型解析を進めている。これまでに、Lr8のKOメダカ系統（lr8-KO）の作出に成功し、その表現型解析を行った。その結果、lr8-KO系統メダカの孵化仔魚の生残率が野生型のそれよりも低下することが示された。さらにlr8-KO系統メダカにおいては、4種のVtg（VtgAa1、VtgAa2、VtgAb、VtgC）のうち、VtgAb由来の卵黄タンパク質成分が野生型と比べて相対的に減少しており、Lr8がVtgAbタイプの主要な受容体であることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
用いた実験系のほとんどは既に確立されていたため、本年度に予定していた計画のほぼ全てを順調に進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題毎の方策を以下に記載する。
課題1（油球形成機構の解析）：lpl1遺伝子について、これまでにその有効性が確認されたgRNAを用いてKO魚を作出し、その表現型解析により、卵内での油球形成に及ぼすlpl1-KOの影響を明らかにする。KO魚を作出し、その表現型解析を行う。また、Lpl以外の油球形成関連因子として、遊離脂肪酸の卵内への取り込みに関与する脂肪酸交換輸送体（Fat）や脂肪酸輸送タンパク（Fatp）について、メダカ卵濾胞における遺伝子発現パターンを解析し、その結果、油球形成への関与が強く示唆されたものについて順次KO魚の作出・表現型解析を進める。
課題2（卵黄球形成機構の解析）：Lr7とLrp13の2種リポタンパク種受容体のそれぞれについて、KO魚を作出し、lr8-KO魚と同様の表現型解析により、Lr7とLrp13の卵黄形成（卵へのVtgの取り込み）における役割を明らかにする。また同時に、メダカ卵濾胞組織における3種リポタンパク質受容体（Lr7、Lr8、Lrp13）の時間・空間的発現パターンを遺伝子・タンパク質の双方のレベルで解析する。
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