サンゴ抗菌ペプチドの立体構造解析による膜作用機構の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05768
• Research Institution: Tokyo University of Marine Science and Technology
• Principal Investigator: 岡井 公彦 東京海洋大学, 学術研究院, 准教授 (00596562)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高木 俊幸 東京大学, 大気海洋研究所, 助教 (00814526)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 立体構造解析 / 抗菌ペプチド / サンゴ

Outline of Annual Research Achievements

「海のゆりかご」とも呼ばれるサンゴ礁には全海洋生物の約25%が生息しており、生物多様性の保全上、極めて重要な生態系である。近年の海水温上昇は海洋病原細菌の毒性を上昇させ、細菌性白化や組織分解によるサンゴ礁の破壊を引き起こしている。サンゴを含む無脊椎動物には病原細菌から身を守るための自然免疫機構が備えられており、病原細菌を認識後、シグナル伝達を介して抗菌ペプチド（Antimicrobial peptide; AMP）を生産することが知られているものの、サンゴにおいてはAMPの存在や種類が特定されておらず、免疫機構は不明なままである。本研究ではこれらのAMPの立体構造解析と膜作用機序解析を行い、免疫機構の分子メカニズムを明らかにする。
本年度は大腸菌Rosetta-gami2(DE3)による発現系を構築し、2種類のAMPの可溶性画分への発現を確認した。Niアフィニティカラムを用いて精製後、プロテアーゼによりHis-Trx領域とAMPを切断した。切断した2つは再度Niアフィニティカラムに通すことで、AMPのみスルーで回収することができ、高純度に精製することができた。精製したAMPの内、1種類について酵母、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌に対する抗菌活性を測定した。96-well plateの中で菌体と様々な濃度のAMPを混合して24-48時間静置し、吸光度測定によりMIC（Minimum inhibitory concentration）を決定した。菌体の増殖が確認されなかった混合溶液は寒天培地に塗布し、30℃で一晩静置培養後、コロニーの生育の有無を元にMBC（Minimum bactericidal concentration）を決定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究申請時の計画ではまずAMPは全RNAの逆転写を行い合成されたcDNAを用いてPCR増幅し、組換えタンパク質発現用ベクターに挿入後、発現用大腸菌宿主へ導入し、発現確認することであった。これはRosetta2(DE3)と細胞内を酸化状態にしたRosetta-gami2(DE3)で試した結果、Rosetta-gami2(DE3)でより高発現が確認された。続いて組換えペプチドにHisタグを付加し、Niアフィニティカラムで精製することで単一バンドになるまで精製された。抗菌活性では96-well plateを用いて酵母、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌に対して定量的なMIC、MBCの数値を算出することができ、申請計画通りに研究が進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

AMPの膜作用機序を明らかにするため、人工合成したリポソームとAMPの相互作用試験、リポソームの孔形成能試験、細菌膜透過性試験を行う。
また、精製したAMPを用いてスクリーニングを行い、結晶を得る。得られた結晶は更に最適化し、放射光施設Photon Factoryでデータ取得を行う。取得したデータは研究室のパソコンで処理し、立体構造を決定する。

Causes of Carryover

AMPの発現系作製や精製が順調に進んでおり、発現系作製で使用するベクター及び精製で使用する樹脂が研究申請計画より少量であった。次年度は結晶化スクリーニングキット、膜との相互作用試験、細菌の孔形成能試験、膜透過性試験に必要な試薬及び装置に使用する。