2021 Fiscal Year Research-status Report

Elucidation of in situ lignin biodegradation using bacterial sensor

Research Project

Project/Area Number	21K05872
Research Institution	Nagaoka University of Technology
Principal Investigator	上村直史長岡技術科学大学, 工学研究科, 助教 (50646528)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	亀井一郎宮崎大学, 農学部, 教授 (90526526)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	リグニン / フェルラ酸 / バニリン酸 / センサー / 環境試料 / バクテリア / 蛍光タンパク質 / 転写制御
Outline of Annual Research Achievements	リグニンは自然界で「真菌等による高分子構造の解体」と「生成した芳香族化合物の細菌による代謝」を経て無機化される。一方、環境中ではリグニンの解体で生成する芳香族化合物が速やかに分解されるため、化学分析ではほとんど検出されない。このため、環境中ではどのような化合物がリグニンの解体で生成し細菌により代謝されているのかは明らかでない。本研究では、申請者が開発した様々な低分子芳香族化合物の代謝を検出できるセンサー細菌を利用し、自然環境におけるリグニン由来化合物の存在と、真菌による木材腐朽時に実際に細菌がリグニン解体物を代謝するかどうかの解明を目的とした。これまでに作出してきた、様々なリグニン由来化合物を代謝できるSphingobium sp. SYK-6株を宿主としたセンサーが、環境試料において適用可能かどうか調査した結果、フェルラ酸センサーにおいて8種類中2種類の森林土壌で蛍光が見られたことから少なくとも特定の土壌試料に適用できることが認められた。液体クロマトグラフィー分析から、用いた試料にはバニリン酸等の単量体が極めて微量に含まれる場合が見られたがいずれもフェルラ酸は検出されなかった。SYK-6株は、高分子のリグニンを分解できないが、SYK-6株を宿主とした本センサーはケイヒ酸類を経由する極めて多様な範囲のリグニン由来の二量体や単量体を代謝するとともに蛍光を発することから、液体クロマトグラフィー分析では見いだされなかった環境試料に含まれていた二量体等の微量だが多様な化合物がSYK-6株により代謝され蛍光応答に至ったと良そうされた。また、センサー対象化合物のバリエーションを広げるため、これまでに明らかにしてきたビフェニル型二量体化合物であるジバニリン酸の分解遺伝子の転写制御システムを活用したセンサーを開発した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 様々なリグニン由来化合物を代謝できるSphingobium sp. SYK-6株を宿主としたセンサーが、環境試料において適用可能であることを見出した。また、本株の特徴である二量体等を含む幅広い代謝基質範囲により、液体クロマトグラフィー分析では検出できないリグニン由来化合物が環境試料に存在し、これらをバクテリアが代謝していることを裏付ける証拠を得ることができた。また、センサー対象化合物のバリエーションを広げるため、ビフェニル型二量体化合物であるジバニリン酸のセンサーを開発した。
Strategy for Future Research Activity	１）センサー細菌のバリエーション拡大：Sphingobium sp. SYK-6株の芳香族代謝誘導性のプロモーターを新規センサー化する。これまでに、β-1型二量体化合物、アセトバニロン、プロトカテク酸の代謝時にそれぞれ誘導されるプロモーターと各プロモーターの制御因子を見出している。これら制御システムをセンサー用プラスミドに導入して、検出できる化合物濃度と基質の範囲を調査する。２）環境中のリグニン由来化合物分析：リグニン量と真菌の活動が活発な環境として森林土壌、腐朽木材、堆肥など、リグニン量が少なく真菌がほとんどいない環境として泥、海水、河川水などに対してセンサー細菌を反応させ、これら試料に応答可能な化合物が含まれるかどうか調査する。また、化合物分析については低分子芳香族の存在量が少ないことを考慮し、はじめに各試料を水または弱酸で懸濁して有機溶媒抽出により濃縮する。その後、HPLC-ESI-MS分析により、センサーが応答した低分子芳香族化合物を推定する。３）真菌による木材腐朽およびリグニンの解体時におけるセンサー細菌の応答性：Trametes属やPhanerochaete属等の一般的な白色腐朽菌株を数株用い、木材腐朽過程で行われるリグニンの解体で生じる化合物をセンサー細菌が応答できるかどうか明らかにする。研究分担者の宮崎大学の亀井教授が白色腐朽菌を用いた実験を担当する。白色腐朽菌株が接種された木片、木粉に対してセンサー細菌が応答するかどうか調査する。
Causes of Carryover	令和3年度は研究の進行状況の部分的な遅延および当初の計画と異なる成果が得られたことにより、研究分担者が担当する計画を大きく縮小することとしたため、分担者に振り分けられた予算の大部分を繰り越すこととした。当該研究分担内容は令和4年度に実施するため、繰り越した予算は令和4年度に使用することを計画している。