2021 Fiscal Year Research-status Report
Investigation of stem cell niche in developing ruminal epithelial tissue
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21K05900
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
鈴木 裕 北海道大学, 農学研究院, 助教 (10793846)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
芳賀 聡 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 畜産研究部門, 主任研究員 (90442748)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ウシ / ルーメン上皮細胞 / 組織発達 / 制御因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ウシの反芻胃（ルーメン）は離乳後の成長期に急速に発達するが、その細胞的・分子的な機序には不明な点が多い。当グループは予備研究において、ルーメン上皮では基底層のみに増殖活性を持つ細胞群が存在することを見出した。これらの細胞が組織幹細胞あるいは前駆細胞として振る舞うことで、ルーメン組織の発達に関与すると考え、その細胞の増殖や制御する組織内の微小環境（ニッチ）の存在を仮定して、その解明を目指した。
本年度はニッチを構成する分子の探索を目指した。まず、ルーメンで発現するニッチ因子を同定するために、レーザーマイクロダイセクションによりルーメン上皮細胞と固有層を分取する方法の確立を目指したが、薄切組織中RNAの保存性が十分ではなかったため、改善作業を継続している。代替策として、凍結した組織全体からRNAを抽出し、ニッチ構成分子として予想される細胞外マトリックスと成長因子の発現解析を行った。様々な上皮組織において細胞増殖制御に関与することが知られるラミニンおよびEGF、FGF、TGF-bファミリーの発現が確認された。相関分析から、これらの中の一部の因子はルーメン上皮細胞の増殖活性（マーカー遺伝子発現量）と強い相関を持つことが明らかになった。
本年度の研究結果から、ルーメン上皮細胞を取り囲むニッチ因子としてラミニンや各種の成長因子が示唆された。今後は網羅的解析により他のニッチ候補分子を探索するとともに、培養ルーメン上皮細胞などを用いてニッチ候補分子の直接的な生理的な役割を明らかにすることを目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上皮細胞の生育を制御する液性因子（成長因子など）は固有層から分泌されることから、本年度の当初計画では、レーザーマイクロダイセクションによりルーメン上皮細胞と固有層を分取し、さらにRNA-seqを組み合わせてニッチ候補分子を網羅的に探索することを目指した。はじめに、薄切したルーメン上皮組織から室温環境下でインタクトなRNAを抽出する方法を検討した。既報の方法を試行したが、RNAの分解が見られたため改良を試みた。その結果、RNAの分解はある程度抑制されたが、RNA-seqに供するレベルには至っておらず、引き続き改善作業を継続している。
上記の方法による網羅的探索に課題が生じたため、qPCRによる遺伝子発現解析を同時並行して行った。一般的に上皮細胞の細胞増殖制御に関与することが知られる代表的な因子に絞って、ルーメンが発達中の離乳前後の子牛を用いて解析を行った。その結果、細胞外マトリックスとしてラミニン、成長因子としてEGF、FGF、TGF-bファミリーの一部に顕著な発現変動が見られ、さらに上皮細胞の増殖活性との相関が見られた。
以上のように、ニッチ因子探索において当初計画した方法に課題が生じたため、代替策を取ることとなった。探索できた因子の数に制限が生じたが、ルーメン上皮細胞の増殖に関与することが予測される分子を同定することができたため、研究は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度は、まず2021年度に課題が生じたレーザーマイクロダイセクションの改良を目指す。RNA分解酵素の阻害分子を使用することにより、RNAの安定性について改善されたが、結果にばらつきが生じているため、より安定した方法の開発を目指す。十分の品質のRNAを採取が可能であれば、当初計画していたRNA-seqを行い、ニッチ因子候補を網羅的に探索する。その後は、当初の2022年度案である「組織内でのニッチ候補分子局在の解明」と「SCFAによるニッチ候補分子の発現調節作用の検討」に取り組む。ニッチ候補分子局在の解明においては、主に蛍光免疫染色法により、候補分子の組織内での局在や産生細胞の同定を目指す。SCFAによるニッチ候補分子の発現調節作用の検討では、過去の実験で得られたルーメン上皮組織サンプルまたは培養ルーメン上皮細胞を用いて、SCFA処理時のニッチ候補分子の発現変動を検討し、ルーメン組織発達時の発現変動と一致するものを特定する。これらの実験により、ニッチの候補分子の中から蓋然性の高いものを特定することを目指す。
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| Causes of Carryover |
RNA-seqのために予算を計上していたが、方法論的な課題が生じ、実施することができなかったため次年度使用額が生じた。2022年度の研究において、実験法の改良を完了させ、本来予定していたRNA-seqを実施するために当該の残余額を充当する。
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Research Products
(2 results)
