2022 Fiscal Year Research-status Report
胚の着床能力獲得機構の解析と移植に最適な胚を選抜する評価法の樹立
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21K05903
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
松本 浩道 宇都宮大学, 農学部, 教授 (70241552)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福井 えみ子 宇都宮大学, 農学部, 教授 (20208341)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 繁殖 / 生殖 / 着床 / 受胎 / 妊娠 / 胚培養 / 体外受精 / 胚盤胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
体外受精胚の移植では受胎率および産子率が低い。これまでの多くの研究にもかかわらず改善されていない。このことは新規のアプローチが必要であることを示している。これまで着床と妊娠の成立に関する研究に取組み、マウス胚の着床能力獲得過程に関するタンパク質の発現や分解の制御機構について新知見を報告してきた。また、それらの分子機構を指標として、胚盤胞における遺伝子とタンパク質の発現を培養系で賦活化し、母体由来のシグナルに対する応答能力を高めた状態にして子宮へ胚移植するというアプローチで、マウス体外受精由来胚盤胞の着床能力を改善する手法を構築した。
着床率が改善されたということは、通常の培養系では着床しない胚における着床能力に正の効果があった結果である。一方、胚盤胞が着床能力を獲得する分子機構の解明には、着床能力において負に作用する因子も同定し、それらを組合せて解析することが有効である。
これまでの研究で、アミノ酸の組合せがマウス胚の着床率を正と負に制御することが示唆されていた。そこで、アルギニン（Arg）とロイシン（Leu）がマウス胚の着床能力関連因子の発現に及ぼす影響を解析した。
マウス胚用の培養液にArgまたはLeuを添加し、胚盤胞を培養後に胚移植を行ったところ、Argは着床率を低下させたのに対し、Leuは着床率に影響しなかった。一方で、ArgとLeuの複合処理は着床率を上昇させた。O2消費量はArgおよびArg+Leuにより低下した。活性酸素種（ROS）はArgで上昇し、Arg+Leuによりさらに上昇した。着床関連因子であるインテグリンα5β1（ITGA5B1）発現は、Argでは変化せず、Arg+Leuで上昇した。以上のことから、Arg+LeuではROSの上昇に伴い、ITGA5B1の発現が上昇することで着床率が改善された可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、胚盤胞の着床能力に関する研究をより進展させ、胚移植における着床率と産子率を改善させることを目的としている。そのために、培養液成分の検討による間接的な評価法に加え、生存性を維持して個々を評価・選抜した良好胚を移植する直接的な胚質評価法を構築する。胚着床の機序解明を進展させ、着床率を向上させることを本研究のゴールとしている。
本年度は、胚をライブで直接評価した後に、胚を固定し免疫組織化学的 評価を行う手法の作出を行なった。蛍光色素で細胞内のライブアッセイを行うことで、ROS産生量を解析する手法を構築した。同一胚における着床能力指標因子ITGA5B1の発現動体を解析した。さらにROSとITGA5B1の相関解析により、着床能力を改善するArg+Leuの採用機序を検討した。その結果、ROSの上昇に伴い、ITGA5B1の発現が上昇することで着床率が改善された可能性が示唆された。この成果は学会にて発表している。
以上のことから、現在までの進捗状況は概ね順調な進展であると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
・胚の着床能力獲得機構の解析
これまでにアミノ酸の組合せがマウス胚の着床率を正と負に制御することを報告している。すなわち、アルギニン（Arg）とロイシン（Leu）の複合処理は着床率を上昇させる。一方で、Arg単独は着床率を低下させるが、Leu単独では着床率に影響しない。そこでインテグリンやプロスタグランジン合成酵素などの着床能力関連因子にどのような作用機序があるかを明らかにする。ROSの上昇に伴い、ITGA5B1の発現が上昇することで着床率が改善された可能性が示唆されたことから、ROSとITGA5B1の関連性についての解析を展開する。
・胚をライブで直接評価する手法の作出
細胞内NOのライブアッセイを行う。またO2消費、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種も同時に解析する手法を構築する。個々の胚で複数のガス代謝関連因子の作用を解析し、個別胚の着床能力評価条件を確定させていく。共焦点レーザー顕微鏡で定量および産生細胞の局在を解析する。また実用化のために、より簡便な目視判定を蛍光顕微鏡で評価する手法の構築も試みる。さらに、各測定因子の推定至適範囲にあるマウス胚盤胞を移植し着床能力を解析する。推定至適範囲より高い胚と低い胚も移植し、3群の着床率を比較して適正範囲を確定させる。胚移植後に得られた産子の正常性を確認する。極端に産子率が低いなどの異常があった際には、各試薬の濃度を低くするか、別の試薬を検討する。
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| Causes of Carryover |
タンパク質の発現解析や胚移植などについて、いくつかの実験項目が予定よりはかどらなかった。以上の理由から、次年度使用金額が生じた。
これについては、実験を円滑に進める為の物品費として使用する。また、研究成果を学会等で発表するための旅費としても使用する。
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