2021 Fiscal Year Research-status Report
Research for the three-dimensional culture of porcine spermatogonial stem cells (SSCs) and the perfusion organ culture of testicular organoids.
Project/Area Number |
21K05904
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Research Institution | Shinshu University |
Principal Investigator |
高木 優二 信州大学, 学術研究院農学系, 准教授 (20226757)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Keywords | 精子幹細胞 / 精原細胞 / セルトリ細胞 / ブタ / 器官培養 / 精子形成 |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究は単離したブタのセルトリ細胞と精子幹細胞を、人為的に3次元的な精細管環境を再現することにより、幹細胞ニッチを再構築し、体外で幹細胞を増殖させることを目的とする。2021年度は以下のことを明らかにした。 1.ブタ精巣細胞の冷蔵保存法:ブタ精巣を入手するには養豚農家の去勢作業日程の制約を受ける。制約解消のため、50ml遠心チューブ用ブロックとペルチェ素子による温度制御装置を自作し、保存温度と液組成について検討した。浸透圧調整したトレハロース含有液で細胞濃度を低く保つことで、80%以上の生存率で4日間短期保存できる手法を確立した。 2.トリプシン処理によるブタ精原細胞の単離:トリプシン振盪処理にて精原細胞を95%以上の純度で単離できること、精原細胞でエンドペプチダーゼインヒビター関連の遺伝子群の発現が高く、特にITIHを高発現していることを報告してきたが、精巣細胞がどの様に消滅していくのか不明であった。そこでトリプシン静置処理でのタイムラプス観察により体細胞および精原細胞の動きや崩壊の仕方を明らかにした。 3.微小ペリスタポンプを用いた灌流器官培養装置の作製:再構築精細管を器官培養するための灌流装置を、微小ステッピングモータとペリスタポンプを用いて製作した。プログラミングにより液量を調整でき、通気性EVAフィルムでカバーされたゲル包埋法により採取した精細管を培養し、AlubMax添加により3週間培養できる系を構築した。しかし培養液組成や下垂体ホルモンの添加などまだまだ検討の余地が残された。 4.CMCキトサンカプセルへの細胞封入:セルトリ細胞と精子幹細胞からなる幹細胞ニッチを再構築するための微小細胞カプセル化について検討した。カプセル素材および膜形成条件とともに、高精度ディスペンサーにより、短時間にμlオーダーの均一微小細胞カプセルを作成できるようになった。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2021年度に実施予定であったブタ精巣からのセルトリ細胞の単離が、セルトリ細胞の純度が低く達成出来なかった。そのため、単離したセルトリ細胞を用いて実施する予定であった「セルトリ細胞の発現遺伝子プロファイルをRNA-seq(外注)にて網羅的に解析する」等の研究を行えなかった。OptiPrep密度勾配遠心だけでなく低張液処理との併用などでセルトリ細胞の純度を上げることが期待できることと他の課題の進展から、やや遅れていると判断した。
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Strategy for Future Research Activity |
1)ブタセルトリ細胞の単離と培養:2021年度に達成できなかったので再検討を行う。幼若精巣の40%を占めるセルトリ細胞を、低張液処理とOptiPrep密度勾配遠心の併用で分離する。精子幹細胞へのパラクリン作用を明らかにするために、セルトリ細胞の発現遺伝子プロファイルをRNA-seq(外注)にて網羅的に解析する。 2)精子幹細胞の3次元培養:3次元培養のための様々な基材が市販されるようになった。単離精原細胞をマトリゲルに封入し、その増殖への影響を調べる。接着因子や細胞外マトリックスの細胞増殖と遺伝子発現への影響とともに、受容体の発現情報をもとに成長因子、シグナル伝達の阻害剤の影響についても検討し、増殖促進機構を明らかにする。セルトリ細胞の網羅的発現遺伝子の解析結果から増殖に関与する因子を中心に調べる。 3)セルトリ細胞による幹細胞のニッチ培養:セルトリ細胞からのニッチ因子の供給や相互作用、精細管の再構築能を検討するために、セルトリ細胞の混合割合を変化させてその影響を調べる。下垂体ホルモンと共に種々成長因子の効果を精子幹細胞の増殖、マーカー遺伝子発現、再構築された精細管構造の形態観察にて評価する。2021年度に条件設定したCMCキトサン微小細胞カプセル内での増殖条件を明らかにする。これらのことから精細管ニッチを体外で再現する手法を構築する。 4)再構築精細管の灌流器官培養:2021年度に作製した灌流器官培養装置システムを用いて、セルトリ細胞との3次元培養による再構築精細管にて、長期培養(60日間)に取り組む。分化誘導因子や減数分裂誘導因子を加えることで、分化・減数分裂マーカーを指標に分化能について調べる。ここまで全て順調に進んだ場合には、体外培養での円形精細胞までの分化、さらには精子までの形態形成に挑戦してみたい。
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Causes of Carryover |
2021年度の実験計画で予定していた「ブタ精巣からのセルトリ細胞の単離と培養」において、ブタ幼若精巣からのセルトリ細胞の単離が上手く実施できなかった。そのため単離した高純度セルトリ細胞を用いて、当初予定していた「セルトリ細胞の発現遺伝子プロファイルをRNA-seq(外注)にて網羅的に解析する」ために確保していた70万円近くの予算を執行出来なかった。2022年度中にRNA-seqで解析できる純度までセルトリ細胞を単離して網羅的解析を実施する。
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