長期維持型卵胞の形成増強法の開発および卵胞動態制御への影響の解析

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05906
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 杉本 実紀 京都大学, 農学研究科, 助教 (20243074)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 卵巣 / 哺乳類 / 雌 / 生殖寿命 / 卵胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、哺乳類の卵巣で性成熟後まで休眠・維持されて生殖寿命後期の卵子産生に寄与する長期維持型卵胞形成の増強により雌の生殖寿命を延長することは可能か、また、早期発育型卵胞の減少が卵胞動態への影響を与えるかを解析しようとしており、そのために長期維持型卵胞を形成する顆粒層前駆細胞の採取、解析、細胞の追加や機能性因子による操作等を行うことを計画している。本年度は、マウス胎仔／新生仔卵巣において長期維持型顆粒層前駆細胞と推定されているLgr5発現細胞と同じ細胞集団において高発現であったと報告されたGng13の機能解析の一環として、前年度までに作製したGタンパク質シグナル伝達経路の刺激剤を添加培養したマウス胎仔卵巣標本について先に解析を行った高濃度添加区の50%および25%濃度添加区の標本も観察したところ、これらでも高濃度添加区と類似した変化が一部で観察されたが濃度依存的な一定の傾向とはなっていなかった。上記の刺激剤は比較的広い範囲の因子に作用し効果の特定には他の方法による検討も必要であることから当初はRNA干渉による発現抑制を検討したが、確実な抑制が難しいと考えられたため、別の方法として公共データベースにおいてGng13をシグナル伝達に使用する受容体を検索し過去の論文等からマウス胎仔／新生仔卵巣において発現している可能性があるものを選び、これに対する刺激剤の効果を器官培養系で検討した。別の細胞種で細胞死抑制効果が報告されていた濃度を参考に、2レベルの処理区を設定した。実験回数および有効な標本数が少なく確実性に欠けるが、低濃度処理区で上記の刺激剤での処理と類似した形態変化が観察された。一方、高濃度処理区では異なる変化が見られ、高濃度では効果が変化する、または、異なる作用が重複して発生している可能性が考えられた。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

機能性因子の作用の検討について、得られた標本の解析が未完了で結果が確定できなかった。細胞分画の条件設定については、有効な手法改善が考案できず進めることができなかった。

Strategy for Future Research Activity

Gng13の刺激および上流の受容体の刺激の効果に関して採取済みの標本の解析を行い、効果の有無およびどのような効果であるかを把握するとともに、阻害剤処理や発現抑制等による特異的作用の確認を検討する。細胞分画・採取については、別の研究でマーカーとして有効な可能性がある因子の情報が得られたので、発現を免疫染色で再検討すると共に、これを用いた細胞分画・採取や機能解析を行う。長期維持型顆粒層前駆細胞の採取が可能になれば、遺伝子発現に基づく機能解析や卵巣への追加の効果の検討を行う。いずれも培養期間の長期化等、培養系で得られる情報を増やすことで使用する動物数の削減に務めるが、培養系で効果を示す因子が同定できれば、移植や個体への投与により効果を検討する。また、組織形態の解析について正確性と効率を上昇させるために手法の改善を試みる。

Causes of Carryover

全体に着手が遅れ、購入する試薬類の選択に時間がかかったため。次年度の試薬、器具類、実験動物の購入、共通機器使用料、遺伝子解析等の外部委託の費用に使用する。