2022 Fiscal Year Research-status Report
Study of DNA damage and repair mechanism in porcine embryos obtained from vitrified oocytes and zygotes, and its relevance to genome editing
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21K05912
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| Research Institution | National Agriculture and Food Research Organization |
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Principal Investigator |
ソムファイ タマス 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (90547720)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原口 清輝 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 上級研究員 (10324576)
菊地 和弘 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, グループ長補佐 (20360456) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ブタ接合体 / ガラス化保存 / ゲノム編集 / OCT4 / CD46 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
卵母細胞ならびに胚のRad51 免疫染色を試みたが、現在、効率的な抗体が入手・利用できないため、信頼できる結果は得られなかった（供給業者は、以前は品質の高い抗体の生産・販売を行っていたが中止した）。したがって、Rad51の計測は、遺伝子発現の結果(RT-qPCR) として呈示する。その後、以下に示す研究プロジェクトの次の段階に移行した。エレクトロポレーションを介したCRISPRcas9を使用してOCT4 またはCD46 遺伝子またはその両方をノックアウトすることにより、体外成熟/受精によって作製し、ガラス化/加温したブタ受精卵にゲノム編集を適用した。各実験区で、ゲノム編集による胚盤胞への発生を確認した。 さらに、ブタ接合体のガラス化保存後、OCT4/CD46ダブルノックアウトして、胚盤胞を作ることに成功した。低温保存されたブタ受精卵からのゲノム編集胚の作製の初めての成功例である。ガラス化またはゲノム編集単独では、胚盤胞の生産率は低下しなかった。しかし、それらの組み合わせは胚盤胞への発生を低減させた。それでも、ゲノム編集後に胚盤胞まで発育したガラス化接合体の割合は20％以上でした。ゲノム編集された胚盤胞は小さく見える。また、遺伝子配列の確認により、受精卵のガラス化は、得られた胚盤胞におけるゲノム編集の効率を低下させないことが明らかとなった。現時点では、胚盤胞率の低下が、変異導によるものか、ガラス化保存およびエレクトロポレーションによるストレスの蓄積によるものかは明らかではない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
実験の実施時期と進行は、当初の研究計画に従って行われた。エレクトロポレーションを介したGEのプロトコルが確立し、その後、OCT4、CD46および両方のノックアウト実験を、それぞれ 6 回、5 回、4 回反復し、未保存の受精卵とガラス化した受精卵で行った。これにより主な目標の2番目について達成することができた。超低温保存された受精卵から初めてGE胚を作製することに成功した。その結果は、次年度の論文掲載に向けて取りまとめている。ただし、胚の質を検討するために、さらなる実験が必要となっている。令和4年度には、得られた結果を2報の原著論文で発表した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ガラス化受精卵のGEによって生成された胚盤胞の品質(細胞数)を評価する必要がある。 さらに、受精卵のガラス化とGEの組み合わせによる胚盤胞発生の減少が、遺伝子型あるいはストレスの蓄積(ガラス化保存とその後のエレクトロポレーション)によってもたらされることを明らかにする必要がある。後者の場合、エレクトロポレーションのタイミングならびに条件の最適化を検討する。
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| Causes of Carryover |
令和4度に注文した試薬が売り切れた。試薬は令和5年度に再度注文する予定です。
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