Identification and functional analysis of circular RNA derived from bovine trophoblast cells

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05933
• Research Institution: Iwate University
• Principal Investigator: 木崎 景一郎 岩手大学, 農学部, 教授 (40337994)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 環状RNA

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、昨年度に得られたcircRNAシーケンス（circRNA-seq）の結果から抽出した胎盤に発現するcircRNAの同定を試みた。ウシ胎盤節・絨毛叢に高発現するbta-circ_9746について、circRNA を特異的に検出するdivergent primerを用いてRT-PCRを行った。divergent primerは、host geneの直鎖状mRNA （host gene mRNA）では認められないback splicing junctionを含む領域を増幅するプライマーである。その結果、予想された193 bp付近に増副産物が検出されたが、500 bp付近にも増幅産物が認められた。これら2つの増幅産物について、DNAシークエンスにより塩基配列を調べたところ、193 bp付近の増副産物はback splicing junctionを1つ有するhost gene mRNA由来の配列であることがわかった。一方、500 bp付近の増副産物は2つのback splicing junctionを有していた。環状構造を有するRNAであるか否かを検証するために、RNase R処理、あるいは未処理のRNAを鋳型としてcDNAを調製した。RNase Rは直鎖状mRNAのみを分解し、環状RNAには作用しないRNA分解酵素である。RNase R処理及び未処理cDNAを用いたRT-qPCRによる定量の結果、RNase R処理cDNAではhost gene mRNAは検出されないが、bta_circ_9746は検出された。さらにRNase R処未理cDNAではhost gene mRNA及びbta_circ_9746はともに検出されたことから、bta_circ_9746は環状構造のRNA由来であることが明らかになった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ウシ胎盤に発現するcircRNA として、bta_circ_9746を同定した。

Strategy for Future Research Activity

今後、bta_circ_9746以外に候補に挙がっているbta-circ_8048、1913及び6638についての同定作業を進めるとともに、胎盤以外の他の組織での発現分布やcircRNA/host gene mRNA比等について検討する。また、各circRNA中のマイクロRNA結合部位についても調べ、その機能の推定も試みる。

Causes of Carryover

今年度はcircRNA検出のための特異的divergent primerの設計やRNase R処理条件の検討に若干の時間を要し、一部のcircRNAの同定、定量が次年度に持ち越しとなったため、次年度使用が生じた。令和5年度に実施予定である。