Development of new technology to improve conception rate after artificial insemination using frozen dog semen

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05945
• Research Institution: Nippon Veterinary and Life Science University
• Principal Investigator: 堀 達也 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 教授 (80277665)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: 犬精液 / 低温保存 / 精子細胞膜 / 精子先体膜 / ミトコンドリア膜電位

Outline of Annual Research Achievements

以前、長期低温保存精液を用いた犬の人工授精において、8日以上保存した精液では十分な精子数と精子運動性を維持していたにも関わらず受胎しないことが明らかとなり、犬精子の受精能力の低下を引き起こす機能的な障害の1つとして考えられるDNA断片化率の検査を行ったが明らかな異常は認められなかった。そこで今回は、長期低温保存精液が受精能力の低下を引き起こしている原因を明らかにすることを目的とし、フローサイトメトリーを用いた精子の細胞膜、先体膜およびミトコンドリア膜電位についての解析を行った。
精液希釈液として卵黄トリス・フルクトース・クエン酸液を用い、長期低温保存を行った。精液採取実施日を0日目とし、3、6、9、12、15日目に精子運動性解析装置（SMAS）による精子活力の測定と、フローサイトメトリーを用いた精子の細胞膜、先体膜およびミトコンドリア膜電位の解析を行った。精子細胞膜の評価には、核酸染色であるSYBR-14/PI二重染色、先体膜の評価には、先体の糖鎖を認識して結合するPNA-FITC/PI二重染色、ミトコンドリア膜電位の評価には、膜電位に依存した蓄積を呈するJC-1染色を用いた。
その結果、精子活力、正常細胞膜、正常先体膜および高ミトコンドリア膜電位を有する精子の割合はいずれも時間経過とともに減少したが、受精能の喪失が示唆される低温保存6日目と9日目の間に受精能に影響がでると考えられる差は認められなかった。ただし、9日目以降では、正常細胞膜を有する精子の割合は精子活力と比べ低い傾向にあった。精子細胞膜の機能は、精子との受精に必要である。そのため、この損傷が低温保存における受胎率低下の原因の1つである可能性が示唆された。
以上の結果から、精子活力よりも細胞膜損傷のほうが低温保存精子の受精能を評価する指標になることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

凍結精液を非外科的に人工授精を行うための硬性鏡の購入が遅くなり、現在、実験を開始している。結果が出るまでに少し時間がかかるため、計画している実験に少し遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究として、犬凍結精液の融解液の開発に関する実験として、ミトコンドリア機能を改善するミオイノシトールと、精子の運動性を向上するためのカフェインを添加した時の凍結融解後の精液性状の変化についての研究を実施している。この結果をもとに、独自の融解液の作成を検討している。また、同時に犬凍結精液を用いた経頸管内子宮内人工授精を計画している。この時に用いる凍結精液は、通常のものと融解液を使用したものとで比較を行うこととし、融解液の使用が受胎率にどのように影響を与えるかどうかについて検討する。

Causes of Carryover

凍結精液を非外科的に人工授精を行うための硬性鏡の購入が遅くなり、現在、実験を開始している。結果が出るまでに少し時間がかかるため、計画している実験に少し遅れが生じている。そのため、予算の使用額も少なかった。研究期間を1年延長したため、残りの期間で予算を使用する予定である。これまでと同様の実験を繰り返して行うため、予算としては液体窒素や試薬などの購入が中心になると計画している。