2021 Fiscal Year Research-status Report
分離困難ウイルスの分離に向けたスパイクアダプター法の開発
| Project/Area Number |
21K05948
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Technology, Kumamoto College |
|---|
Principal Investigator |
吉永 圭介 熊本高等専門学校, 生産システム工学系BCグループ, 准教授 (30513238)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大場 真己 東京農工大学, 農学部, 特任准教授 (30816559)
水谷 哲也 東京農工大学, 農学部, 教授 (70281681)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | 発現レベルの向上 / セレクション法の改良 / 凸面ライブラリの構築 / FIPV結合性クローン |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
令和３年度当初、凹面ライブラリは一度構築済みであったものの、LRR抗体タンパクのファージ粒子上への発現レベルが低く、セレクション時にクローンをとりこぼすことが懸念された。発現レベルの向上を目指し、NTドメインをほかの配列に変更してライブラリ構築をやりなおした。結果、発現レベルがいくぶん向上した凹面ライブラリを構築することができた。凹面ライブラリの構築と発現レベルの向上の段階をまとめて、１２月に国際学会で口頭発表した。また、ライブラリ構築に関するノウハウや詳細な実験条件が定まったため、一連の手法をプロトコール集としてまとめることができた。
研究分担者によって、FIPVをセレクションに使用できるレベルの量を調製することができた。調製したFIPVを用い凹面ライブラリから、３ラウンドのセレクションをおこなった。セレクション後のクローンについてELISA法によってFIPV結合能の評価をおこなった。これまでにFIPV結合クローンが数クローン得られ、それらの塩基配列から予定結合領域のアミノ酸配列を明らかにしている。また、セレクション時に、遺伝子配列が不完全でLRR抗体C末端側に融合したg3コートタンパクを正常に発現しないクローンをうまく排除するしくみも開発することができた。
凸面ライブラリについても、凹面ライブラリでの経験を活かし、凹面と同じNTドメインを用いることとした。凸面ライブラリの設計、必要なオリゴDNAの合成をおこなった。凹面ライブラリで作成したプロトコールは凸面ライブラリの構築にそのまま適用することができた。現在は凸面ライブラリの構築まで進んでおり、凸面ライブラリは完成間近である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では、令和３年度は、(1): LRR抗体の凹面のライブラリよりFIPVに結合するクローンのセレクション、および(2): 凸面ライブラリの構築、の予定であった。
凹面ライブラリは一度構築済みであったものの、LRR抗体タンパクの発現レベルが低いため、NTドメインを変更してライブラリ構築をやりなおした。その後、上記(1)の予定通り、FIPVに対するセレクションをおこないFIPV結合クローンが数クローン得られている。また上記(2)の計画についても、凸面ライブラリの設計、必要なオリゴDNAの合成、凸面ライブラリの構築まで進んでいる。よって、おおむね計画通りに進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和４年度は、構築した凸面ライブラリをもとにVero細胞表面に結合するクローンのセレクションをおこなう。また、凹面ライブラリからもさらにFIPV結合クローンの数を増やす。各クローンがそろった段階で、Vero細胞結合性クローン（凹面）とFIPV結合性クローン（凸面）のアミノ酸配列を遺伝子レベルで重ね合わせることで、両面がカップリングしたヤヌス化抗体を作製する。作製したヤヌス化抗体それぞれについて、FIPV結合能およびVero細胞結合能を維持しているかを解析する予定である。
順調に進めば、令和５年度に、作製したヤヌス化抗体をもちいてFIPVをVero細胞に結合および感染できるかを解析する予定である。
|
| Causes of Carryover |
当初、研究分担者のVero細胞調製用、およびVero細胞表面分子の組み換えタンパクの購入用として考えていたが、令和３年度に凸面ライブラリ構築が完了しておらず、必要とする時期が先に延びたため。使用計画として、次年度にVero細胞調製用、およびVero細胞表面分子の組み換えタンパクの購入用に使用予定である。
|
