2023 Fiscal Year Research-status Report
分離困難ウイルスの分離に向けたスパイクアダプター法の開発
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21K05948
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| Research Institution | National Institute of Technology, Kumamoto College |
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Principal Investigator |
吉永 圭介 熊本高等専門学校, 生産システム工学系BCグループ, 准教授 (30513238)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大場 真己 東京農工大学, 農学部, 准教授 (30816559)
水谷 哲也 東京農工大学, 農学部, 教授 (70281681)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Keywords | インターナライズ / VeroE6 / セルパンニング / パラトープ解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和5年度は、令和4年度に凹面ライブラリよりセレクションした、VeroE6に結合およびインターナライズするクローンについて、ファージミドDNAを抽出し塩基配列を解析した。塩基配列をもとに細胞への結合に関与するパラトープの特徴を明らかにした。各クローンのインターナライズする能力を評価するため、各クローンを提示したファージを調製し、VeroE6細胞に導入させた。導入されたファージを細胞内画分より回収し、大腸菌へ感染させることでタイターを計測したが、データのばらつきが大きく定量的な評価をすることができなかった。細胞導入後または回収の際にファージにダメージがあったためと考えられた。
凸面ライブラリより単離したFIPV結合クローンについて、ELISA法によりFIPV結合能を再評価した。結合能とアミノ酸配列との比較により、結合に関与するアミノ酸残基の特徴がわかり、今後２次ライブラリを作る際の重要な知見が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では年度内に、細胞にインターナライズするクローンの評価、凹面/凸面クローンのカップリング（ヤヌス化）、ヤヌス化後の結合能解析の予定であったが、諸般の事情によりヤヌス化まで到達できなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
VeroE6へインターナライズするクローン（ファージ）を蛍光色素で標識し、VeroE6細胞へのインターナライズの様子を蛍光顕微鏡で観察し定量をおこなう。また細胞へのインターナライズがどの経路を用いているか各種阻害剤を使用して解析予定である。
FIPV結合クローンの凸面と、VeroE6インターナライズクローンの凹面を遺伝子レベルでカップリング（ヤヌス化）する。ヤヌス化後のクローンについて、FIPV結合能、VeroE6へのインターナライズを確認する。両性質を保持していた場合、FIPVをVeroE6に感染（または導入）させることが可能かを解析する。
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| Causes of Carryover |
当初、ヤヌス化に必要な物品の購入を予定していたが、ヤヌス化まで進まず、必要とする時期が先に延びたため。使用計画については、令和6年度にヤヌス化および感染実験の遂行のために使用予定である。
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