2021 Fiscal Year Research-status Report
新規カニクイザル発生工学技術を用いた栄養膜特異的ノックアウト法の開発
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21K05988
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
岡村 永一 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 助教 (30755913)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水野 直彬 東京大学, 医科学研究所, 特任研究員 (30815642)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 栄養膜細胞 / カニクイザル / ノックアウト / 着床 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は哺乳動物の胚盤胞期胚において栄養膜細胞特異的に遺伝子をノックアウトする技術を開発し、未だ謎に包まれたヒトを含む霊長類における着床の分子メカニズムを明らかにすることである。このために、超効率的トランスジェニック法と透明帯透過型AAV(アデノ随伴ウイルス)ベクターを用いた新規手法を確立する。
今年度はまずトランスポゼースを用いて大きなトランスジーンDNAをマウス受精卵に効率的に導入するための条件検討を行った。RNAやDNAの濃度、および、導入方法を至適化検討を行った結果、9割以上の受精卵がトランスジーンを保持する条件を見出すことに成功した。また、EGFP発現カセットを搭載したAAVを用い、栄養膜細胞が特異的にAAVに感染するウイルス濃度の至適化を行った。
その他、CRISPR/Cas9システムによりノックアウトを行うためのgRNA/Cas9共発現ベクターの構築を行った。この際、確実にノックアウトを行うため恒常性gRNA発現ユニットは3つタンデムに連結する工夫を施した。またこのベクターが機能的であることを培養細胞株を用いて確認した。
さらに、マウス受精卵を用いた実験結果から得られた知見に基づき、トランスポゼースを用いてカニクイザル受精卵においてトランスジーンを導入するための条件検討を行なった。その結果、これまでレンチウイルスベクターでは不可能であった8kbpを超える大きなトランスジーンDNAをカニクイザルゲノムに挿入することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画よりもトランスポゼースによる受精卵へのトランスジーン挿入の条件検討に時間を要した。そのため、AAVを用いた実験計画が遅れている。一方で、カニクイザル受精卵を用いた実験は当初計画よりも進展があったため、全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画はおおむね順調に進展しているため、今後も計画に従い、トランスポゼースとAAVを用いた栄養膜細胞特異的ノックアウト法の確立に向けて着実に実験を進めていく。
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| Causes of Carryover |
今年度に計画していた受精卵に対するAAVの感染実験が遅れているため、関連試薬の購入が当初見込みより少なかった。この実験は次年度に実施するため、次年度に必要な物品を購入する。
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