Functional analysis of the Trap Clone Accumulated Area (TCAA).

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 21K05999
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 荒木 正健 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (80271609)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 吉信 公美子 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 助教 (20274730) ; 荒木 喜美 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (90211705)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 遺伝子トラップ / 胚性幹細胞 / Oct4 / ATAC-Seq / マウス

Outline of Annual Research Achievements

我々は、遺伝子トラップクローン（TC）の解析を行う際に、遺伝子は無いのにTCが集積している領域を発見した。このような領域をTCAA (Trap Clone Accumulated Area)と呼ぶことにする。
本研究課題の申請において、TCAAの生理機能を推定するために、過去の実験で得たマウスES細胞におけるRNA-Seq, ATAC-Seq及びOct4-ChIP-SeqのデータをUCSC Genome Browser (mm9)に登録し、Chr.1, 4, 7, 11, 18, Xについて解析していた。
2021年度は、残りのChr.2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19の解析を行なった。その際、対照群として、遺伝子もTCもない領域（C1及びC11）、既知遺伝子を含む領域（G1及びG11）、ES細胞の多能性維持に関与していると考えられている遺伝子を含む領域（GP）についても併せて解析した。その結果、TCAAは、染色体全体において、有意に発現していること、クロマチンがオープンになっていること、及びES細胞の多能性維持に重要な働きをしている可能性があることを示すことができた。
また、ES細胞の多能性維持に必要な遺伝子であるLifの下流に位置しているTCAA11-1のノックアウトマウスを作製し、その表現型解析を行なった。その結果、TCAA11-1は、Lif遺伝子のエンハンサー活性を持つゲノム領域であることが示唆された。
さらに、ゲノムブラウザに登録されているエピゲノム情報も利用して主成分分析（PCA）を行い、興味深い結果を得た。2022年度は、このPCAの結果を踏まえて特徴的なTCAAを選択し、ノックアウトマウスを作製する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

TCAAの生理機能を推定するために、マウスES細胞におけるRNA-Seq, ATAC-Seq及びOct4-ChIP-SeqのデータをUCSC Genome Browser (mm9)に登録し、Chr.2, 3, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19の解析を行なった。その際、対照群として、遺伝子もTCもない領域（C1及びC11）、既知遺伝子を含む領域（G1及びG11）、ES細胞の多能性維持に関与していると考えられている遺伝子を含む領域（GP）についても併せて解析した。その結果、RNA-Seqに関して、TCAAは既知遺伝子ほど高くはないが、C1及びC11とは明らかに異なりES細胞における発現が示された。またATAC-Seqに関して、TCAAの平均値及び中央値は既知遺伝子と同レベルであった。このことは、多くのTCAAのクロマチンがオープンになっていることを示している。さらにOct4-ChIP-Seqについて、TCAAの値はG1及びG11よりも有意に高く、GPと同程度であった。このことは、TCAAがES細胞の多能性維持に重要な役割を果たしている可能性を示唆している。
また、ES細胞の多能性維持に必要な遺伝子であるLifの下流に位置しているTCAA11-1のノックアウトマウスを作製し、その表現型解析を行なった。その結果、TCAA11-1は、Lif遺伝子のエンハンサー活性を持つゲノム領域であることが示唆された。
さらに、ゲノムブラウザに登録されているES細胞（E14）のH3K4me1（エンハンサー活性とリンク）、H3K4me3（プロモーター活性とリンク）及びH3K9me3（リプレッサー活性とリンク）の情報も利用して主成分分析（PCA）を行い、興味深い結果を得た。

Strategy for Future Research Activity

ES細胞におけるRNA-Seq, ATAC-Seq及びOct4-ChIP-Seqのデータに、ゲノムブラウザに登録されているエピゲノム情報も利用して主成分分析（PCA）を試みている。まだ始めたばかりであるが、興味深い情報が得られつつある。
さらにゲノムブラウザ上の様々な情報を利用して、PCA分析を行うことにする。その結果として、特徴的な領域を選別し、ノックアウトマウスを作製する。TCAAを除去したマウスの表現型を解析し、その生理機能の推定を行う。

Causes of Carryover

2021年度に行なったTCAAのゲノム・エピゲノム解析の結果を利用して、2022年度にノックアウトマウスを作製し、その表現型解析を行う予定である。そこで、マウス飼育経費を確保するために、初年度に使用予定していた予算の一部を次年度に回すことにした。

Research Products

• [Journal Article] LincRNA‐p21 exon 1 expression correlates with Cdkn1a expression in vivo (2021)
  • Author(s): Furuhata, R., Imasaka, M., Sugimoto, M., Yoshinobu, K., Araki, M., Araki, K.
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 27 Pages: 14～24
  • DOI: 10.1111/gtc.12906
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Gene trapping reveals a new transcriptionally active genome element: The chromosome‐specific clustered trap region (2021)
  • Author(s): Takeda, I., Araki, M., Ishiguro, K., Ohga, T., Takada, K., Yamaguchi, Y., Hashimoto, K., Kai, T., Nakagata, N., Imasaka, M., Yoshinobu, K., Araki, K.
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: 26 Pages: 874～890
  • DOI: 10.1111/gtc.12890
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The lncRNA Caren antagonizes heart failure by inactivating DNA damage response and activating mitochondrial biogenesis (2021)
  • Author(s): Sato, M., Kadomatsu, T., Miyata, K., Warren, J. S., Tian, Z., Zhu, S., Horiguchi, H., Makaju, A., Bakhtina, A., Morinaga, J., Sugizaki, T., Hirashima, K., Yoshinobu, K., Imasaka, M., Araki, M., Komohara, Y., Wakayama, T., Nakagawa, S., Franklin, S., Node, K., Araki, K., Oike, Y.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 12 Pages: 2529
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22735-7
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] MicroRNA-142 Critically Regulates Group 2 Innate Lymphoid Cell Homeostasis and Function (2021)
  • Author(s): Roberts Luke B.、Jowett Geraldine M.、Read Emily、Zabinski Tomas、Berkachy Rita、Selkirk Murray E.、Jackson Ian、Niazi Umar、Anandagoda Nelomi、Araki Masatake、Araki Kimi、Kasturiarachchi Jagath、James Chela、Enver Tariq、Nimmo Rachael、Reis Rita、Howard Jane K.、Neves Joana F.、Lord Graham M.
  • Journal Title: The Journal of Immunology Volume: 206 Pages: 2725～2739
  • DOI: 10.4049/jimmunol.2000647
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Tamoxifen feeding method is suitable for efficient conditional knockout (2021)
  • Author(s): Yoshinobu Kumiko、Araki Masatake、Morita Ayaka、Araki Miyuki、Kokuba Shun、Nakagata Naomi、Araki Kimi
  • Journal Title: Experimental Animals Volume: 70 Pages: 91～100
  • DOI: 10.1538/expanim.19-0138
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Mir142 loss unlocks IDH2 R140-dependent leukemogenesis through antagonistic regulation of HOX genes (2021)
  • Author(s): Marshall, A., Kasturiarachchi, J., Datta, P., Guo, Y., Deltcheva, E., James, C., Brown, J., May, G., Anandagoda, N., Jackson, I., Howard, J-K., Ghazaly, E., Brooks, S., Khwaja, A., Araki, M., Araki, K., Linch, D., Lord, G-M., Enver, T., Nimmo, L.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 11 Pages: 6974
  • DOI: 10.1038/s41598-020-76218-8
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 自然発生突然変異マウス『pocy』の多血機序の解析 (2022)
  • Author(s): 北元優梨, 増田好美, 古閑成美, 吉信公美子, 中潟直己, 鳥越大輔, 中村直子, 柳久美子, 要匡, 髙岡裕, 荒木喜美, 荒木正健
  • Organizer: 2021年度先端モデル動物支援プラットフォーム成果発表会
• [Presentation] 潜性（劣性）遺伝形式を示す自然発生多血症モデルマウス『pocy』の解析 (2021)
  • Author(s): 北元優梨, 増田好美, 古閑成美, 吉信公美子, 中潟直己, 鳥越大輔, 中村直子, 柳久美子, 要匡, 髙岡裕, 荒木喜美, 荒木正健
  • Organizer: 日本遺伝学会第93回大会
• [Presentation] LincRNA-p21 遺伝子領域における転写は隣接するCdkn1a の転写活性化に重要であ る (2021)
  • Author(s): 古畑理樹, 今坂舞, 荒木正健, 吉信公美子, 荒木喜美
  • Organizer: 日本遺伝学会第93回大会
• [Presentation] Trap Clone Accumulated Area（TCAA）は胚性幹細胞の多能性維持に関与している可能性がある (2021)
  • Author(s): 荒木正健, 齋藤桂花, 昇地高雅, 久場兼裕, 吉信公美子, 山根万里子, 丹羽仁史, 荒木喜美
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
• [Presentation] マウスゲノム領域"CSCT"の特徴 (2021)
  • Author(s): 吉信公美子, 川下真奈, 荒木喜美, 荒木正健
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会
• [Presentation] 潜性（劣性）遺伝形式を示す自然発生多血症モデルマウス『pocy』の解析 (2021)
  • Author(s): 増田好美, 北元優梨, 吉信公美子, 中潟直己, 鳥越大輔, 中村直子, 柳久美子, 要匡, 荒木喜美, 荒木正健
  • Organizer: 日本ゲノム編集学会第６回大会
• [Presentation] ゲノム編集を用いた2-3MbにもわたるKRAB-ZNFクラスター領域の欠損アレルの作製 (2021)
  • Author(s): 荒木喜美, 吉信公美子, 荒木正健
  • Organizer: 日本ゲノム編集学会第６回大会
• [Remarks] Database for the Exchangeable Gene Trap Clones
  • URL: http://egtc.jp