2022 Fiscal Year Research-status Report
配偶核形成に必須の新奇なゲノム切断について，クロマチン再構築を伴う修復機構の研究
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21K06009
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
福田 康弘 東北大学, 農学研究科, 助教 (50527794)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | テトラヒメナ / DSB / Iswi / Rad5 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
繊毛虫テトラヒメナの有性生殖では，生殖核から配偶核が分化する過程において，DNA 損傷応答に誘発されたクロマチン再構築が起こる．有性生殖が始まると，まず生殖核は減数分裂を行い 4 つの半数体性の核が生じる．直ちに全ての半数体核ゲノムにおいて DNA 切断が生じ，4 つのうちから選択された 1 つの核だけで DNA 切断は修復される．この DNA 修復を受けた選択核が配偶核へ分化する．これまで進めてきた研究から，選択核では DNA 切断の修復と同時にユークロマチン化の指標が生じること，また減数分裂後の DNA 切断が不全になるとユークロマチン化も起こらず，配偶核の形成が不全になることが明らかになっている．本研究の目的は，選択核が受ける DNA 修復およびゲノムユークロマチン化に携わる分子機構を明らかにすることである．まず本研究では，DNA 修復系にかかわることが知られている遺伝子のホモログをテトラヒメナのゲノム情報から探し出し，それらの網羅的な局在解析を進めた．これから選択核に局在する DNA 修復因子のホモログが複数特定された．続いて，選択核に局在することが分かった様々な DNA 修復因子の候補から，発現量などに基づいて機能的な重要性が予測された因子を選び，それらの KO/KD 解析を行った．その結果，Rad5 ならびに IswiG の 2 つが，選択核ゲノムに生じた DNA 切断の修復と，その DNA 修復に伴うユークロマチン化に携わる重要な分子であることが明らかになった．ここまでの新たな知見は，既に国際誌 Microorganisum（doi.org/10.3390/microorganisms10122426）において発表した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生殖核から配偶核が形成される過程では，DNA 損傷応答に伴うクロマチン再構築が生じる．このクロマチン再構築は，次代の形成に不可欠なクロマチンのリプログラミングを配偶核に施していると考えられる．本研究では，Rad5 ならびに IswiG の 2 つが選択核の DNA 損傷応答に関わることが明らかになった．この解析から明らかになった特筆すべき点として，DNA 修復因子が欠損した細胞の配偶核形成では，DNA 修復のみならず，選択核のユークロマチン化も不全になることがあげられる．これは選択核が受ける DNA 修復とユークロマチン化の両者は，カップリングして制御されることを示唆している．これを参考とする新たな解析として，Rad5 や Iswi と共役する分子の探索を始めたところである．これまでの局在解析で作出した Rad5-EGFP 発現細胞と Iswi-EGFP 発現細胞を用いて，免疫沈降と質量分析を進めている．また，本研究で進めている選択核の DSB 損傷応答に携わるタンパク質の探索では，配偶核形成と有性生殖に携わる様々な新規タンパク質が複数見つかった．これらには減数分裂や細胞接着にもかかわるタンパク質も含まれている．したがって本研究から得られる成果は，繊毛虫テトラヒメナの有性生殖を支配する分子機構の俯瞰的理解にも繋がることが期待される．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は当初の計画に沿って順調に進展している．選択核の DNA 修復に携わることが明らかになった Rad5 および Iswi を手がかりとして，それ共役してゲノムのユークロマチンをもたらす分子の特定に挑む．この解析では共免疫沈降と質量分析を用いる．
繊毛虫テトラヒメナの有性生殖を支配する分子機構の俯瞰的観測は，本研究の目的と強く結びつく．このことから，選択核の DSB 損傷応答に携わるタンパク質の探索において発見された配偶核形成と有性生殖に携わる新規タンパク質においても，局在解析，KO/KD を用いた機能解析，また共役タンパク質の解析を進めることとする．現在，減数第一分裂前期において特異的に発現し，配偶核形成にも関わるタンパク質が新たに見出された．機能解析を進めていたところ，これが相同染色体の対合に携わる新奇なタンパク質であることを示す結果が得られている．
当初の計画であげた選択核や配偶核で特異的にあらわれるエピジェネティクス指標の探索についても，適宜進める．これは，市販されている抗修飾ヒストン/抗修飾塩基認識抗体を用いた間接蛍光抗体染色法での解析である．現在のところ，抗体の特異性の検証を進めている．
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は，次の２点である．
１）当初計画では，タンパク質の解析において海外に在住する協力研究者との現地検討を計画していた．また国際学会での発表を見据えた経費も予算に計上していた．だが，新型コロナウイルス感染症による渡航制限が生じたため，これらの渡航費は使用されなかった．
２）候補遺伝子の選抜と解析が当初の予定よりも順調に進み，網羅的解析に費やす経費が適切に圧縮された．
これらの理由で生じた次年度使用額について，この先に展開するオミクス解析などの予算に充足することを検討している．これにより，当初に配分された予算枠内において，計画よりも規模を拡充して解析を進めることが可能になる．
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