2022 Fiscal Year Research-status Report

RNP remodeling by RNA helicase UAP56

Research Project

Project/Area Number	21K06016
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	谷口一郎大阪大学, 大学院生命機能研究科, 特任助教(常勤) (00467432)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Keywords	RNA核外輸送 / RNP
Outline of Annual Research Achievements	真核細胞のmRNAは核内で合成された後、一群のRNA結合タンパク質とともにhnRNPと呼ばれる複合体を形成する。その後、核外輸送タンパク質因子群がmRNAに結合することによってmRNAは細胞質へ輸送される。mRNA核外輸送において、別種のU snRNAの核外輸送因子PHAXがmRNAに結合して、その結果、誤った経路で輸送される可能性が考えられた。我々は以前、PHAXのmRNA結合を防ぐ仕組みとして、hnRNP構成タンパク質因子であるhnRNPCのmRNAへの結合が重要であることを報告した。PHAXのmRNA結合の阻害後には、hnRNPCのmRNAからの解離がmRNA核外輸送に重要であることも示した。ただし、hnRNPCのmRNAからの解離の仕組みは不明である。当該年度では、解離の仕組みを明らかにする目的で、hnRNPCの活性に焦点を絞って解析を行った。スプリントライゲーション法を利用した試験管内RNA-タンパク質結合実験系を構築することによって、hnRNPCがmRNAの5'末端のキャップ構造から隙間なくRNAに結合すること、さらに、その結合にはキャップ結合タンパク質複合体CBCが必要であることを示した。また、アフリカツメガエル卵母細胞への顕微注入実験によって、生細胞においてhnRNPCの4量体形成がU snRNA核外輸送経路利用の抑制に重要であることを示した。以上の結果を国際雑誌Nucleic Acids Research誌で発表した。 mRNA核外輸送とは対照的に、U snRNA核外輸送に関与するRNAヘリカーゼは未知である。これまでにUAP56を候補因子として同定していた。当該年度では、試験管内反応系を構築することにより、UAP56がATP依存的にPHAXのRNA結合を促進することがわかった。また、PHAXとUAP56を含む新規タンパク質複合体を同定した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason hnRNPCはmRNAに結合することによってPHAXのmRNA結合を阻害するが、その詳細なメカニズムは不明であった。この問題を解明するため、さまざまなhnRNPC変異体の組換えタンパク質を精製し、独自の試験管内RNA-タンパク質結合実験を行った。その結果、CBCとhnRNPCがmRNA上で直接相互作用することを明らかにした。また、両タンパク質因子間の相互作用により、hnRNPCはキャップ構造から隙間なくmRNAに結合することを示した。さらに、試験管内および細胞内RNA-タンパク質結合実験を行い、hnRNPCの4量体形成がそのRNA結合に必要であることと、hnRNPCによるPHAXのmRNA結合阻害に重要であることを明らかにした。以上の結果から、hnRNPCによるPHAX阻害の詳細なメカニズムを示すことができた。以上の解析とあわせて、さまざまなRNAの3'末端形成を制御するARS2に関して、そのmRNA結合をhnRNPCが阻害するという新規活性を見出した。これらの成果を論文発表するに至った。
Strategy for Future Research Activity	試験管内反応系を構築することにより、hnRNPCのRNAからの解離を促進する候補因子としてUAP56を同定している。今後は細胞内においてUAP56が解離するかを検証する。そのために、UAP56ノックダウンや機能欠損変異体の過剰発現によって、細胞内のhnRNPCのmRNA結合が増強するかを調べる。細胞内のhnRNPCのRNA結合に関しては、紫外線クロスリンクとmRNAプルダウン実験を組み合わせた実験を行う。また、構造学的解析を行うことにより、UAP56によるHNRNPCの解離の仕組みを明らかにする。具体的には、UAP56がHNRNPCを1分子のRNAから解離する様子を高速原子間力顕微鏡を利用して観察する。また、HNRNPCとRNAとの複合体の単粒子解析を行う。
Causes of Carryover	論文投稿料支払い後、学内のオープンアクセス掲載支援により助成いただいた。現在投稿中の論文の投稿料支払いに充てる予定である。